Feasibility of RNA Sequencing from Human Skin Microbiopsies in Actinic Keratosis and Basal Cell Carcinoma: A Paired Pilot Comparison with Shave Biopsy

Resumo Técnico: Viabilidade de Sequenciamento de RNA de Microbiópsias de Pele Humana em Ceratose Actínica e Carcinoma Basocelular

Problema
As biópsias de corte (shave biopsies) convencionais são o padrão para diagnóstico dermatológico e pesquisa molecular, mas apresentam limitações quanto à invasividade. Essa invasividade restringe a amostragem de locais cosmeticamente sensíveis, dificulta avaliações longitudinais repetidas e pode desestimular o recrutamento para estudos exploratórios. Embora a microbiópsia de pele submilimétrica ofereça uma alternativa minimamente invasiva e sem sutura para amostragem molecular, há uma falta de evidências pareadas comparando sua eficácia contra a biópsia convencional especificamente para sequenciamento de RNA (RNA-seq) em lesões derivadas de queratinócitos.

Metodologia
Este estudo conduziu uma comparação piloto pareada exploratória envolvendo duas lesões humanas: uma ceratose actínica (AK, amostra RH001) e um carcinoma basocelular (BCC, amostra RW002). Cada lesão foi amostrada utilizando tanto uma biópsia de corte convencional quanto uma microbiópsia. O fluxo de trabalho incluiu:

• Processamento de RNA: Avaliação da integridade e concentração do RNA, seguida de preparação de biblioteca de RNA-seq de fita simples (stranded).
• Sequenciamento: As bibliotecas foram sequenciadas como leituras pareadas de 100 pb em uma plataforma Illumina HiSeq 2000.
• Bioinformática: O controle de qualidade foi realizado com FastQC e Trim Galore. As leituras foram alinhadas ao genoma humano (hg19) usando TopHat v2.1 (guiado por GENCODE v19). As contagens ao nível de gene foram geradas com HTSeq e normalizadas usando edgeR.
• Análise: A concordância entre os métodos de amostragem foi avaliada via gráficos de dispersão FPKM transformados em log10. A interpretação da expressão de marcadores foi feita por meio de conjuntos de marcadores de origem e anotações de camadas da pele do Human Protein Atlas.

Principais Resultados

• Qualidade e Rendimento de RNA: Como esperado devido ao menor volume de tecido, as amostras de microbiópsia apresentaram concentrações iniciais de RNA significativamente menores (ex: 2,85 ng/µL para microbiópsia de AK vs. 59 ng/µL para biópsia de corte de AK). No entanto, os Números de Integridade de RNA (RIN) permaneceram compatíveis com a preparação de bibliotecas (RIN 5,9 para microbiópsia de AK vs. 6,7 para biópsia de corte; RIN 7,1 para microbiópsia de BCC vs. 7,7 para biópsia de corte).
• Desempenho de Sequenciamento: Apesar do menor input, as bibliotecas de microbiópsia alcançaram altas taxas de mapeamento. No par de AK, 94,8% das leituras remanescentes da microbiópsia foram mapeadas em comparação com 92,5% da biópsia de corte. No par de BCC, 91,5% das leituras remanescentes da microbiópsia foram mapeadas em comparação com 94,7% da biópsia de corte.
• Concordância Transcriptômica: Os perfis de expressão global mostraram forte concordância entre os métodos pareados, com valores de $r^2$ de gráficos de dispersão log10 FPKM de 0,93 para ambas as lesões.
• Interpretabilidade Biológica:
  • Ceratose Actínica: As amostras de microbiópsia mostraram enriquecimento de marcadores de diferenciação epidérmica superficial (ex: FLG, FLG2, CDSN, KRT1, KRT10, CASP14). Por exemplo, a expressão de FLG foi de 713,61 FPKM na microbiópsia versus 76,90 FPKM na biópsia de corte. Inversamente, os transcritos de colágeno (COL1A1, COL3A1) foram menores na microbiópsia, consistentes com o amostragem mais rasa e redução da captura estromal.
  • Carcinoma Basocelular: A microbiópsia reteve a expressão de marcadores associados ao tumor, incluindo KRT17 (3822,90 FPKM na microbiópsia vs. 5090,87 FPKM na biópsia de corte).

Significância e Alegações
Os autores concluem que a microbiópsia de pele humana é viável para gerar bibliotecas de RNA-seq sequenciáveis e recuperar perfis transcriptômicos interpretáveis de AK e BCC. Os dados demonstram que, apesar do menor input de RNA, o método produz dados de alta qualidade com forte concordância em relação às biópsias convencionais.

No entanto, o artigo enquadra explicitamente esses achados como dados de viabilidade, e não como evidência de equivalência diagnóstica ou utilidade clínica. Os autores enfatizam várias limitações:

• O estudo é um piloto com um tamanho de amostra muito pequeno (um par por tipo de lesão) e carece de replicação biológica dentro dos diagnósticos.
• Não houve avaliação de profundidade histológica correspondente.
• Existem metadados incompletos nos métodos da fonte original.

Consequentemente, os autores afirmam que os gráficos de dispersão e de vulcão (volcano plots) não devem ser interpretados como evidência de expressão diferencial ao nível da doença. Eles sustentam que estudos pareados maiores, com amostragem de profundidade padronizada, correlação histológica e deposição de dados reprodutível, são necessários antes de se tirar conclusões ao nível da doença.