Adrenergic nerves regulate B cell responses to large antigens through modulation of lymph node permeability

Resumo Técnico: Nervos Adrenérgicos Regulam Respostas de Células B a Antígenos Grandes via Permeabilidade de Linfonodos

Definição do Problema
Os nervos adrenérgicos inervam todos os órgãos linfoides secundários, embora seu papel específico nas respostas imunes adaptativas permaneça incerto. Embora a depleção sistêmica desses nervos seja conhecida por comprometer a formação de centros germinativos (CG) após infecção ou vacinação, os mecanismos locais pelos quais eles influenciam as respostas das células B não foram definidos. Existe uma lacuna crítica de compreensão sobre como o sistema de conduítes do linfonodo (LN) — uma rede de fibras de reticulina tipicamente restrita a moléculas menores que 70 kDa — lida com antígenos drenados de alto peso molecular (HMW). Não se sabe se este sistema ganha permeabilidade a antígenos drenados de alto peso molecular durante uma resposta imune e se a sinalização adrenérgica impulsiona esse processo. Isso é clinicamente relevante, pois pacientes com lesões de nervos periféricos exibem suscetibilidade a infecções recorrentes, sugerindo um defeito na memória imunológica.

Metodologia
O estudo empregou uma combinação de modelos de depleção nervosa local e sistêmica em camundongos C57Bl/6 para isolar os efeitos dos nervos adrenérgicos na fisiologia do LN.

• Depleção de Nervos: Foram utilizadas duas abordagens: (1) Simpatectomia química sistêmica usando 6-hidroxidopamina (6OHDA) e (2) Depleção local usando um modelo de camundongo TH-Cre iDTR tratado com toxina diftérica (DT) em uma região específica da pata. Este método local permitiu a ablação de fibras adrenérgicas positivas para tirosina hidroxilase (TH+) no linfonodo poplíteo drenante, preservando os linfonodos não drenantes e a fisiologia sistêmica.
• Modelos de Antígeno: Os camundongos foram vacinados com antígenos pequenos (NP-Ovalbumina, ~45 kDa) ou grandes (NP-Hemocianina de Limete de Chaveiro, ~450 kDa; Staphylococcus aureus ~100 gigadaltons).
• Ensaios de Permeabilidade: Para avaliar a permeabilidade do sistema de conduítes, dextrans fluorescentes de tamanhos variados (FITC de 2 kDa e TRITC de 70 kDa) foram injetados na pata 7 dias após a vacinação ou infecção.
• Análise Estrutural: Cortes seriados de LNs foram corados com uma coloração de reticulina de Gomori modificada para visualizar as fibras de reticulina e as trabéculas. O diâmetro das fibras e a conformação da rede foram quantificados.
• Leituras Imunológicas: A formação de centros germinativos foi avaliada via citometria de fluxo (GL-7, Bcl-6, CXCR5, PD-1) e imunofluorescência. Os títulos de anticorpos (anti-NP IgG) foram medidos via ELISA, e a geração de plasmócitos foi quantificada via ELISPOT. O acúmulo de antígeno nos CGs foi visualizado com FITC-Ova e esferas conjugadas com Crimson (Red-KLH).

Principais Contribuições e Resultados

1. Remodelação do Sistema de Conduítes Induzida por Vacinação:
   O estudo demonstrou que a vacinação ou infecção induz uma remodelação estrutural da rede de fibras de reticulina do LN. Em LNs com nervos intactos, essa remodelação cria uma conformação de trabéculas "frouxa, em forma de rede" com um diâmetro médio de 2,2–2,6 µm (comparado a ~1,4 µm nos controles PBS). Essa expansão permite que moléculas de alto peso molecular (dextran de 70 kDa, NP-KLH) penetrem do seio subcapsular (SCS) para os folículos de células B e o sistema de conduítes. Em contraste, moléculas de baixo peso molecular (dextran de 2 kDa, NP-Ova) acessam o sistema de conduítes independentemente dessa remodelação.

2. Nervos Adrenérgicos são Necessários para a Remodelação e Permeabilidade de HMW:
   A depleção local de nervos adrenérgicos impediu a expansão das trabéculas. Em LNs com depleção de nervos, a rede de reticulina permaneceu em uma conformação compacta e "fechada" (~1,5 µm de diâmetro). Consequentemente, o dextran de 70 kDa e antígenos grandes foram restritos ao SCS e não puderam acessar o córtex ou os folículos de células B, enquanto o acesso ao dextran de 2 kDa permaneceu inalterado. Isso indica que a sinalização adrenérgica local é necessária para tornar o sistema de conduítes permeável a antígenos drenados de alto peso molecular.

3. Impacto Diferencial nas Respostas de Células B:
   A incapacidade de antígenos grandes acessarem o córtex do LN na ausência de nervos levou a defeitos específicos na imunidade de células B:

• Antígenos Grandes (NP-KLH): A depleção local de nervos prejudicou significativamente a formação de centros germinativos, reduziu as células T auxiliares foliculares (Tfh) e diminuiu o acúmulo de antígenos grandes dentro dos CGs em desenvolvimento. Embora os títulos primários de anticorpos tenham sido comparáveis, a resposta de anticorpos secundária (de memória) foi atenuada em camundongos com depleção de nervos.
• Antígenos Pequenos (NP-Ova): A resposta de centro germinativo, o número de células Tfh e os títulos de anticorpos para antígenos pequenos foram amplamente inalterados pela depleção de nervos, uma vez que esses antígenos não requerem remodelação de conduítes para o acesso.
• Resgate pelo Dose de Antígeno: Aumentar a dose de um antígeno grande (Big NP-Ova conjugado a esferas de 2 µm) de 10 µg para 100 µg resgatou a formação de centros germinativos e a resposta de anticorpos de memória nos camundongos com depleção de nervos, sugerindo que o defeito é de disponibilidade/acesso de antígeno, e não uma incapacidade fundamental de responder.

4. Acúmulo de Antígeno em Centros Germinativos:
   Em camundongos com nervos intactos, tanto antígenos pequenos (FITC-Ova) quanto grandes (Red-KLH) acumularam-se nos CGs. Em camundongos com depleção de nervos, enquanto os antígenos pequenos acumularam-se normalmente, o acúmulo de antígenos grandes (Red-KLH) nos CGs foi substancialmente reduzido, correlacionando-se com o prejuízo na resposta de CG.

Significância e Alegações
O artigo alega que os nervos adrenérgicos desempenham um papel crucial e local na remodelação da rede de fibras de reticulina do linfonodo para permitir a entrada de antígenos grandes nos folículos de células B. Esta permeabilidade é essencial para uma resposta de células B ideal, incluindo a formação de centros germinativos e a geração de respostas de memória robustas.

Os autores postulam que esses achados fornecem uma explicação mecânica para o motivo pelo qual pacientes com lesões ou disfunções de nervos periféricos são mais suscetíveis a infecções recorrentes: a falha na remodelação mediada por nervos impede que antígenos grandes (e potencialmente patógenos) acessem o sistema de conduítes e os centros germinativos, prejudicando o primming de respostas adequadas de células B de memória. O estudo conclui que a expansão física da rede trabecular é um atributo conservado de LNs em resposta, impulsionado pela sinalização adrenérgica, distinto dos efeitos sistêmicos de estresse ou mudanças na pressão arterial.