The impact of nationwide folic acid fortification on genetic variants associated with conotruncal heart defects

Resumo Técnico: O Impacto da Fortificação Nacional com Ácido Fólico em Variantes Genéticas Associadas a Defeitos Cardíacos Conotruncais

Definição do Problema
As cardiopatias congênitas (CC) são a principal causa de morbidade e mortalidade associadas a defeitos congênitos, embora a etiologia para a maioria dos casos permaneça obscura, envolvendo provavelmente interações complexas entre o risco poligênico e fatores ambientais. Embora a fortificação periconcepcional com ácido fólico seja estabelecida para reduzir o risco de defeitos do tubo neural e de defeitos cardíacos conotruncais (DCCT), os mecanismos específicos permanecem parcialmente compreendidos. Estudos anteriores de epidemiologia genética investigando variantes de genes relacionados ao folato em DCCT forneceram resultados inconclusivos, frequentemente devido a dificuldades em contabilizar a deficiência de folato materno e amostras pequenas. Crucialmente, nenhum estudo comparou diretamente a distribuição de variantes genéticas entre crianças com DCCT nascidas antes e depois do mandato de 1998 nos Estados Unidos para a fortificação de grãos e cereais com ácido fólico. Este estudo aborda a lacuna na compreensão de como uma intervenção nutricional em nível populacional (fortificação com ácido fólico) pode ter alterado a penetrância ou a expressividade de variantes de risco genético para DCCT.

Metodologia
O estudo utilizou dados de sequenciamento genômico do Pediatric Cardiac Genomics Consortium (PCGC), acessados via repositório dbGaP.

• Definição da Coorte: A análise incluiu 1.285 indivíduos de ancestralidade de inferência europeia. A coorte foi estratificada em três grupos:
  1. Grupo analítico completo (todos os participantes, n=1.285).
  2. Subgrupo de DCCT (n=534), incluindo tetralogia de Fallot, tronco arterioso, transposição de grandes artérias tipo D, ventrículo direito duplo e interrompimento do arco aórtico tipo B.
  3. Subgrupo de não-DCCT (n=751), incluindo defeitos septais, lesões de obstrução do lado esquerdo e defeitos de ventrículo único.
• Classificação da Exposição: Os participantes foram categorizados com base no ano de nascimento em relação à política de fortificação com ácido fólico. Aqueles nascidos em 1997 ou antes foram classificados como "pré-fortificação", e aqueles nascidos em 2000 ou depois como "pós-fortificação". Os anos de nascimento 1998 e 1999 foram excluídos para considerar o período de transição da política.
• Processamento de Dados: Os dados de sequenciamento foram alinhados ao GRCh38/hg38 e processados conjuntamente para minimizar efeitos de lote (batch effects). Filtros de controle de qualidade (QC) incluíram qualidade de genótipo >20, profundidade de leitura de alelo >10, frequência de alelo menor >0,01 e equilíbrio de Hardy-Weinberg p > 1x10⁻⁶.
• Análise Estatística: Estudos de associação de genoma completo (GWAS) foram realizados usando regressão híbrida de logistic-Firth sob um modelo genético aditivo (PLINK v2.0). Os dez principais componentes principais foram incluídos como covariáveis para controlar a estratificação populacional. A significância sugestiva foi definida como p < 1 x 10⁻⁵.
• Enriquecimento Funcional: A análise de enriquecimento de conjuntos de genes foi realizada usando DAVID (v6.8) nos 100 genes mais bem classificados de cada modelo. A significância foi avaliada por testes exatos de Fisher modificados com ajuste de taxa de falsa descoberta (FDR) de Benjamini-Hochberg.

Principais Resultados

• Achados de GWAS:
  • Grupo Completo (Modelo 1): 94 variantes foram nominalmente enriquecidas (p < 10⁻⁵). A maioria das variantes foi enriquecida no período pré-fortificação (OR < 1), sugerindo uma mudança em nível populacional onde certas variantes genéticas tornaram-se menos frequentes em casos de CC após a fortificação.
  • Subgrupo de DCCT (Modelo 2): 26 variantes foram identificadas. Notavelmente, duas variantes no gene DHRS3 (rs7551703, OR 2,10; rs6541043, OR 2,21) e quatro variantes no locus PPARGC1β (especificamente dentro do miRNA intrônico MIR378A) foram nominalmente enriquecidas no grupo pós-fortificação (OR 4,47–4,51).
  • Subgrupo de Não-DCCT (Modelo 3): 59 variantes foram identificadas. Variantes em MIR548A1HG e NKX1-1 foram enriquecidas no grupo pré-fortificação, de forma semelhante ao Modelo 1, sugerindo que estas podem representar fatores de risco compartilhados para fenótipos cardíacos mais amplos, em vez de riscos específicos de DCCT.
  • Genes da Via do Folato: Nenhuma variante classicamente associada ao transporte de folato ou ao metabolismo de um-carbono (ex: MTHFR, MTRR, MTR) foi detectada em qualquer modelo.
• Enriquecimento Funcional:
  • No grupo de DCCT, as vias biológicas enriquecidas incluíram sinalização de proteína Rho, dinâmica do citoesqueleto, junções célula-célula e regulação transcricional, consistentes com processos de desenvolvimento cardíaco.
  • No grupo de não-DCCT, os termos enriquecidos incluíram ligação de cromatina e fosforilação oxidativa.
  • Os autores observam que estes resultados de enriquecimento são geradores de hipóteses, pois os valores de p não foram corrigidos para testes múltiplos na interpretação final.

Significância e Alegações
O artigo afirma ser o primeiro a comparar diretamente variantes genéticas em casos de DCCT nascidos antes e depois do mandato de fortificação de ácido fólico de 1998 nos EUA. O estudo postula que a fortificação com ácido fólico atua como um "experimento natural" que pode ter modificado o panorama genômico de loci responsivos ao folato.

• Interação Gene-Nutriente: A identificação de variantes de DHRS3 e PPARGC1β enriquecidas especificamente no grupo de DCCT pós-fortificação sugere uma potencial interação gene-nutriente. DHRS3 está envolvido na homeostase de retinoides, e os autores observam que a deficiência de folato e o desequilíbrio do ácido retinoico estão ambos ligados ao DCCT, sugerindo que o folato pode modular as vias de retinoides. PPARGC1β está ligado à maturação metabólica cardíaca; sua associação no período pós-fortificação pode refletir um viés de sobrevivência devido à melhoria dos desfechos clínicos ao longo do tempo ou interações específicas com o ambiente nutricional alterado.
• Mudança Populacional: O achado de que muitas variantes eram menos frequentes no grupo pós-fortificação em toda a coorte mais ampla sugere que a fortificação pode ter alterado a penetrância de fatores de risco genéticos em nível populacional.
• Interpretação Modesta: Os autores declaram explicitamente que os resultados são "geradores de hipóteses" em vez de confirmatórios, devido ao uso de limiares de significância sugestiva (p < 10⁻⁵) e à falta de dados individuais de folato materno. Eles reconhecem que as mudanças observadas podem ser influenciadas por tendências seculares, como a melhoria nas taxas de sobrevivência para lesões complexas ou mudanças nas características maternas (ex: obesidade, tabagismo) ao longo do período de estudo.

Em conclusão, o estudo fornece evidências de que a fortificação com ácido fólico pode ter influenciado a distribuição de variantes de risco genético para DCCT, destacando uma interação complexa entre o status de folato materno, níveis de retinoide embrionário e vias de desenvolvimento cardíaco.