D-serine suppresses one-carbon metabolism by competing with mitochondrial L-serine transport

技术摘要：D-丝氨酸通过竞争线粒体 L-丝氨酸转运来抑制一碳代谢

问题陈述
L-丝氨酸是一个核心代谢节点，整合了糖酵解、脂质代谢和一碳代谢，对于核酸合成、甲基化和细胞增殖至关重要。在中枢神经系统（CNS）中，L-丝氨酸会被立体异构转化为 D-丝氨酸，后者是一种已知的作为 NMDA 受体共激动剂的神经递质。虽然 L-丝氨酸在神经发育中的作用以及 D-丝氨酸在神经传递中的功能已有定论，但 D-丝氨酸对细胞代谢的影响仍不明确。具体而言，目前尚不清楚 D-丝氨酸是否会影响一碳途径的代谢通量，而这些途径对于未成熟神经细胞和肿瘤细胞的增殖至关重要。

研究方法
本研究采用了一种结合了代谢组学、分子动力学（MD）模拟、酶促实验和功能细胞生物学的多维度方法：

• 代谢组学： 对原代培养神经元（PCNs）和神经母细胞瘤（Neuro2a）细胞进行 L-丝氨酸或 D-丝氨酸处理。使用 LC-MS 进行全局代谢物谱分析，并使用二维 HPLC（2D HPLC）对丝氨酸对映异构体和甘氨酸进行特异性定量。
• 机制分析： 使用分子动力学模拟来模拟 L-丝氨酸和 D-丝氨酸与丝氨酸羟甲基转移酶 2（SHMT2）的结合。通过重组 SHMT2 进行酶促实验以测试直接抑制作用。在半透化的 Neuro2a 细胞中进行线粒体转运实验，测量在存在 D-丝氨酸的情况下对放射性标记的 [³H]L-丝氨酸的摄取情况。
• 基因组分析： 对 Neuro2a 细胞进行 RNA 测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA），以评估转录变化。分析公共数据库中的单细胞 RNA-seq 数据，以绘制跨发育阶段的丝氨酸代谢酶表达图谱。
• 功能实验： 使用 Cell Counting Kit-8 测量神经母细胞瘤细胞系、胶质母细胞瘤细胞系（U87、U251、SF126）以及患者来源的胶质瘤干细胞（GSCs）的细胞增殖情况。使用带有原位异种移植的离体器官切片培养系统来观察肿瘤生长。通过 caspase-3 切割和免疫荧光法评估神经祖细胞（NPCs）的凋亡情况。进行脂质组学和磷脂分析，以排除脂质代谢紊乱的影响。

主要贡献与结果

1. D-丝氨酸抑制一碳代谢： 代谢组学分析显示，D-丝氨酸处理显著降低了细胞内甘氨酸和甲酸盐（一碳途径的关键中间体）的水平，而 L-丝氨酸则增强了这些水平。这表明 D-丝氨酸广泛抑制了一碳通量。
2. 作用机制：竞争性转运而非酶抑制：
   • MD 模拟和酶促实验表明，D-丝氨酸对 SHMT2 的亲和力较低，并不直接抑制其催化活性。
   • 在半透化细胞中的转运实验显示，D-丝氨酸竞争性地抑制了线粒体对 L-丝氨酸的转运（IC50 ≈ 1.6 mM）。这种竞争导致了 SHMT2 所需的线粒体底物枯竭，从而抑制了一碳代谢的起始步骤。
   • 敲低 Sideroflexin 1（Sfxn1，一种已知的线粒体丝氨酸转运蛋白）并未消除 D-丝氨酸的抑制效应，这表明 Sfxn 家族成员在介导这种转运方面具有冗余性。
3. 对神经肿瘤和未成熟细胞的抗增殖作用：
   • D-丝氨酸抑制了神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤和胶质瘤干细胞的增殖，尤其是在 L-丝氨酸/甘氨酸缺失的条件下。
   • 通过补充 L-丝氨酸、甘氨酸、甲酸盐或 5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-meTHF）可以挽救这种生长抑制，证实了其机制依赖于一碳代谢中的叶酸循环。
   • 在离体脑切片培养中，D-丝氨酸显著抑制了原位胶质母细胞瘤异种移植的扩张和侵袭性。
4. 对未成熟神经细胞的选择性毒性：
   • D-丝氨酸诱导了 Nestin 阳性神经祖细胞和发育中神经元的凋亡（caspase-3 切割），但对成熟神经元或星形胶质细胞没有影响。
   • 这种毒性独立于 NMDA 受体激活，因为 NMDA 拮抗剂（MK-801、DCKA）或下游抑制剂无法阻断该效应。
   • 脂质组学分析显示，D-丝氨酸会掺入磷脂酰丝氨酸中，但外源性磷脂酰-L-丝氨酸无法挽救凋亡，从而排除了脂质组成是导致细胞死亡的主要原因。
5. 丝氨酸代谢的发育性转变：
   • 内源性 D-丝氨酸水平在胚胎发育期间极低，在出生后随神经元成熟而增加。
   • 转录组分析表明，神经祖细胞高表达 L-丝氨酸合成酶（PHGDH、PSAT1）和一碳代谢基因，而成熟神经元则下调这些途径并上调 D-丝氨酸合成（Srr）。
   • 这表明存在一种代谢区室化现象：未成熟细胞依赖 L-丝氨酸进行增殖，而成熟神经元则利用 D-丝氨酸进行神经传递，且不承担一碳通量的代谢负担。

意义
本文声称揭示了 D-丝氨酸在细胞代谢中此前未被察觉的立体选择性作用。通过竞争线粒体 L-丝氨酸的转运，D-丝氨酸充当了代谢调节剂，抑制了一碳通量。这一机制解释了为什么 D-丝氨酸对增殖性的未成熟神经细胞和肿瘤细胞具有毒性，而会在成熟、非分裂性神经元中选择性合成。研究结果表明，从 L-丝氨酸到 D-丝氨酸合成的代谢转变，与神经系统的功能转型（从增殖转向神经传递）相一致。此外，该研究提出，通过 D-丝氨酸竞争来破坏线粒体 L-丝氨酸转运，可能是针对依赖线粒体一碳代谢癌症的一种潜在治疗策略，尽管作者指出，直接给药可能会受到行为副作用的限制。