癌症通常始于细胞内部的开关卡在了“开启”位置，驱动其不受控制地生长和分裂。最常见的失控开关之一涉及一种被称为 KRAS 的蛋白质，它充当细胞的分子信号处理器。几十年来，科学家一直认为这种蛋白质无法用药物进行靶向治疗，因为它平滑且湿滑，没有明显的药物可以抓握的部位。然而，研究人员最近发现了一种 KRAS 基因中的特定突变，这种突变在蛋白质表面创造了一个微小的、具有粘性的位点。这一突破使得开发出旨在锁定该位点并关闭信号的药物成为可能。虽然这些新药在治疗肺癌方面展现出了巨大的潜力，但患者的反应各不相同，且有些人会出现意想不到的副作用。这种差异表明，这些药物可能不仅仅是在关闭那个卡住的开关；它们可能还在以科学家尚未完全理解的方式与细胞的其他部分发生相互作用。
在一项新的研究中，研究人员试图通过一种观察药物如何改变细胞内蛋白质物理稳定性的方法，来揭示这些隐藏的相互作用。他们将研究重点放在了一种名为 divarasib 的特定药物上，该药物旨在靶向肺癌中的突变 KRAS 蛋白。虽然寻找药物与蛋白质之间化学键的标准测试仅发现了预期的目标，但研究人员使用了一种不同的方法，即测量蛋白质在暴露于压力时保持形状的能力。通过用该药物处理细胞样本并逐渐增加压力，他们可以观察到哪些蛋白质变得更加稳定并更具抗分解能力。这种技术揭示了 divarasib 不仅仅是粘附在 KRAS 蛋白上，它还与另一种完全不同的蛋白质 RBM39 结合。这一发现意义重大，因为标准测试完全忽略了这种相互作用，这表明该药物与细胞的互动方式比此前认为的更为复杂。
研究人员证实，divarasib 与 RBM39 直接结合，但不形成永久性的化学键，其作用更像是一只稳定的手，将蛋白质固定在一起。在细胞中，这种结合产生了明显的效果：它增加了 RBM39 的含量并使其存在时间更长。当团队观察 divarasib 与另一类被称为“降解剂”的癌症药物之间的相互作用时，这一发现变得更加重要。这类降解药物通过标记 RBM39 进行破坏来发挥作用，从而有效地将其从细胞中移除以停止癌症生长。研究表明，divarasib 起到了对抗这些降解剂的“盾牌”作用。当细胞同时接受 KRAS 药物和降解剂处理时，KRAS 药物阻止了降解剂破坏 RBM39。这种相互干扰意味着这两种类型的药物会相互抵消，降低了其中任何一种有效杀死癌细胞的能力。
除了单纯保护蛋白质之外，研究人员还将这种稳定化的后果追溯到了涉及胰岛素受体的特定信号通路。已知 RBM39 有助于控制遗传指令如何被读取和编辑，研究发现，当 divarasib 使 RBM39 趋于稳定时，它改变了胰岛素受体基因的处理方式。具体而言，它影响了产生的胰岛素受体版本，使平衡向健康细胞中更常见的形式偏移。当研究人员通过降低 RBM39 或胰岛素受体的水平来阻断这一效应时，癌细胞对 divarasib 杀伤力的敏感性降低了。这表明，药物稳定 RBM39 并改变胰岛素受体信号传导的能力，是其发挥作用的关键部分，也可能是导致某些副作用或患者间疗效差异的原因。
这项研究凸显了科学家目前寻找药物靶点的一个关键局限性。传统方法在寻找药物形成化学键的位置方面表现出色，但往往会错过那些药物仅仅是固定住蛋白质而非与之结合的相互作用。通过使用基于稳定性的分析法，研究人员得以观察到一层被传统测试所忽视的隐藏药物活性。这项工作不仅识别出了 divarasib 的一个新靶点，还提供了一种思考这些强力药物如何运作的新方式。它表明，治疗的成功或失败可能取决于多种蛋白质之间的微妙平衡，而不仅仅是药物最初设计的那个目标。对于患者和医生而言，这意味着理解这些次级相互作用对于预测谁能从治疗中获益，以及设计能够协同工作而非相互抵消的更好药物组合至关重要。
技术摘要：KRASG12C 抑制剂 Divarasib 可稳定 RBM39 并拮抗芳基磺酰胺降解剂
问题陈述
共价 KRASG12C 抑制剂（如 divarasib, GDC-6036）已在 KRASG12C 突变型非小细胞肺癌（NSCLC）中展示了临床疗效。然而，治疗反应仍具有异质性，且治疗相关的毒性无法完全通过靶向 KRAS 抑制来解释。虽然半胱氨酸反应性谱分析（基于加合物的化学蛋白质组学）证实了其对突变 KRAS 的高度选择性，但这些方法本质上局限于检测共价相互作用，可能会遗漏与其他蛋白质的非共价结合。作者假设，divarasib 非共价结合的其他非规范靶点可能构成了反应差异性和毒性的基础。
研究方法
为了识别非共价靶点，作者采用了蛋白质稳定性谱分析（SPROX），这是一种基于稳定性的蛋白质组学技术，可在无需共价加合物形成的情况下检测配体诱导的蛋白质折叠稳定性变化。
- SPROX 工作流程： 对 H358 KRASG12C 突变型 NSCLC 细胞裂解物进行处理，分别使用溶剂对照（DMSO）、1 μM divarasib（临床相关浓度）或 100 μM divarasib。样品经过尿素变性梯度处理，随后进行 H₂O₂ 介导的甲硫氨酸氧化。蛋白质经消化、TMT 标记，并通过定量 LC-MS/MS 进行分析。命中项定义为具有显著稳定性偏移的蛋白质（Welch's t-test, P < 0.05; |log2FC| > 0.3）。
- 验证：
- 半胱氨酸谱分析： 重新检查现有的半胱氨酸反应性数据集，以确认 RBM39 上不存在共价加合物。
- 细胞热转变实验 (CETSA)： 在处理了 divarasib 的完整细胞中测量 RBM39 的热稳定性。
- 微标量热泳动技术 (MST)： 定量测定 divarasib 与重组 RBM39 蛋白之间的直接结合亲和力。
- 功能实验： 通过蛋白质印迹法（Western blotting）和 RT-qPCR 评估 RBM39 及其下游靶点的蛋白和 mRNA 水平。环己酰亚胺追踪实验用于测量蛋白质稳定性。细胞活力实验（CellTiter-Glo）评估了 divarasib 与芳基磺酰胺降解剂（indisulam, E7820, dCeMM1）之间的细胞毒性相互作用。
- 组学与生物信息学： RNA-seq 识别了下游基因表达变化。通过 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 数据集进行了相关性分析。计算模拟（Glide）模拟了 divarasib 与 RBM39 RRM1 结构域的结合。
主要贡献与结果
- 将 RBM39 鉴定为非共价靶点： SPROX 分析表明，RBM39（一种必需的剪接因子）是蛋白质折叠稳定性在 1 μM 和 100 μM divarasib 浓度下均显著增加的蛋白。与 KRASG12C 不同，在半胱氨酸反应性谱分析中未检测到 RBM39 的共价加合物，且 MST 证实了其直接的非共价结合，表观解离常数 (Kd) 为 2.5 ± 0.9 μM。CETSA 进一步证实了细胞内的靶点结合。
- 稳定化与拮抗降解作用： Divarasib 处理增加了 NSCLC 细胞中 RBM39 的蛋白丰度，但未改变其 mRNA 水平，表明存在翻译后水平的稳定化。至关重要的是，divarasib 拮抗了由芳基磺酰胺分子胶（indisulam, E7820, dCeMM1）诱导的 RBM39 降解。与降解剂处理后的补偿性转录上调相比，co-treatment（共同处理）恢复了 RBM39 的蛋白水平并抑制了该过程。
- 相互的细胞毒性拮抗： Divarasib 对 RBM39 的稳定化导致了相互的细胞毒性拮抗。Divarasib 减轻了 RBM39 降解剂引起的细胞死亡，而 RBM39 降解剂则从 divarasib 诱导的死亡中挽救了细胞。
- 下游 RBM39–INSR 轴： RNA-seq 和 TCGA 相关性分析确定了胰岛素受体 (INSR) 是与 RBM39 表达呈正相关的下游靶点。Divarasib 介导的 RBM39 稳定化增加了总 INSR mRNA 和蛋白水平，并阻止了由 indisulam 诱导的向促有丝分裂型 INSR-A 异构体（缺失第 11 号外显子）的转变。因此，divarasib 减轻了与 INSR-A 异构体相关的信号输出，即 IGF-2 刺激的 ERK1/2 磷酸化。
- 功能相关性： 敲低 RBM39 或 INSR 会适度但显著地降低 divarasib 诱导的细胞死亡，这表明 RBM39–INSR 轴对 divarasib 的细胞毒性机制有贡献。
意义
本文声称，这些发现确立了 RBM39 作为 divarasib 的一个此前未被认知的非共价靶点，这一机制在传统的基于加合物的靶点脱靶分析中是不可见的。本研究强调了基于蛋白质折叠稳定性的谱分析（SPROX）在扩展小分子作用靶点图谱（超越经典的共价相互作用）方面的效用。
作者指出，divarasib 对 RBM39 的结合揭示了一个非 KRAS 轴，该轴调节细胞对 both divarasib 和 RBM39 降解剂的反应。这种相互作用可能导致了临床上观察到的治疗有效性和毒性的异质性。此外，研究还确定了将 RBM39 降解剂与 divarasib 或其他结合 RBM39 的 KRASG12C 抑制剂联合使用的潜在风险，因为它们可能会相互拮抗彼此的细胞毒性。这项工作作为一种概念验证，证明了基于稳定性的蛋白质组学可以揭示影响药物反应的功能性脱靶效应。
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