Fully Two-Photon-Driven RESOLFT Microscopy for Super-Resolution Imaging inside Tissue
本文介绍了 2P-RESOLFT 显微成像技术，该技术利用双光子驱动激发和可逆光开关效应，实现了在组织深处进行 205 纳米超分辨率成像，并成功揭示了胰腺伪假岛中此前未被观察到的膜突起。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
在人体深处，细胞并非孤立的岛屿，而是繁忙、拥挤的城市的一部分。为了理解它们如何相互交流，科学家需要观察它们表面微小的结构，而这些结构通常埋藏在深层的组织之中。标准显微镜的作用就像强力的手电筒，但它们受限于光的物理特性；无论光束有多强，一旦变得太小，图像就会模糊成一个模糊的圆圈。这个被称为“衍射极限”的限制，长期以来一直阻碍着研究人员观察活体组织内部最精细的细节。虽然一些先进的技术已经设法打破了玻璃片上细胞的这种模糊感，但它们很难在厚实的生物样本深处发挥作用，通常需要复杂的装置，或者会对脆弱的生命材料造成过多的损伤。
一支研究团队现在开发了一种新的方法，可以在组织深处观察这些隐藏的细节，他们将两个强大的理念结合成一种单一且更流畅的方法。第一个理念是双光子激发，这是一种利用两束红外光在同一时刻击中某一点，使细胞的一个微小点发光的技巧。因为这只发生在两束光完美重叠的地方，所以它允许科学家在不产生破坏图像的背景噪声的情况下，深入组织内部进行观察。第二个理念是一种被称为 RESOLFT 的方法，它利用一种特殊的的光模式来关闭除了焦点中心以外的所有发光，从而有效地锐化图像，揭示远小于模糊极限的细节。直到现在，将这两个理念结合起来一直很困难，因为“关闭”的过程通常依赖于另一种在组织深处效果不佳的光相互作用。研究人员通过让整个过程——从开启发光到关闭发光——都由相同的双光子机制驱动，解决了这个问题。
在研究过程中，科学家们专注于一种特定的、可以像灯开关一样被开启和关闭的发光蛋白。他们在活细胞中测试了这个系统，首先是在常见的实验室细胞系中，然后在一种更复杂的模型中：模拟人类胰腺中制造胰岛素的微小岛屿（胰岛）的胰腺细胞簇。通过使用两台激光器——一台形状像实心圆点，另一台形状像空心环——他们能够仅使用双光子光来实现蛋白质的开关切换。结果显示，这种新方法可以分辨出横向分辨率为 205 纳米的结构。换句话说，这大约是标准双光子显微镜所能看到尺寸的一半，这是一个显著的进步，使团队能够辨别出以前仅仅是一团模糊的特征。
最令人震惊的发现出现在他们观察胰腺细胞时。在这些细胞簇内部，这种新型显微镜揭示了从细胞膜延伸出的纤细、脆弱的突起。这些结构如此精细且暗淡，以至于标准显微镜根本无法检测到它们。研究人员观察到，这些突起是细胞膜真实的物理延伸，可能参与了细胞如何与邻近细胞进行交流。这一发现具有重要意义，因为它表明这些细胞相互作用的方式比之前理解的更加复杂，即存在着物理桥梁将它们连接在一起，而这些桥梁在之前的技术中是不可见的。团队通过将微小珠子和细胞结构的图像与计算机模拟进行对比，证实了这种提高的清晰度并非仅仅是软件产生的伪影，而是真实的物理分辨率。
这种新方法的一个关键优势在于其简单性和温和性。与其他需要激光在时间上完美同步的超分辨率方法不同，该系统之所以有效，是因为蛋白质的切换是从一个稳定的、静止的状态而非转瞬即逝的激发态进行的。这意味着两台激光器不需要精确到纳秒级的同步，使得设备更容易构建和操作。此外，由于该方法依赖于双光子光，它对活体组织的损伤较小，且穿透深度比旧技术更深。研究人员发现，通过调节激光的亮度以及相机观察每个点的时间，他们可以在获得清晰图像的需求与保持细胞生存健康的需求之间取得平衡。
这项研究证明了观察多细胞组织亚衍射架构的可能性，为窥探胰腺细胞如何进行通信的结构基础打开了一扇窗。虽然目前的设置使用了一种表现良好的特定蛋白质，但研究人员指出，如果未来开发出性能更强的蛋白质，该方法可能会变得更加锐利。目前，这项工作证明了全双光子驱动的超分辨率成像已成为现实，它无需承担损伤或复杂性的沉重代价，就能为隐藏在生物体深处的微观世界提供更清晰的视野。
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