Deconvolution-based cell-type specific DNA methylation-wide and transcriptome-wide association studies identify risk CpG sites and genes associated with colorectal cancer risk

技术摘要：基于反卷积的细胞类型特异性 DNA 甲基化全基因组和转录组范围关联研究识别了与结直肠癌风险相关的 CpG 位点和基因

问题陈述
传统的基于大块组织（bulk-tissue）的 DNA 甲基化全基因组关联研究（MWAS）和转录组范围关联研究（TWAS）已成功识别了许多与结直肠癌（CRC）风险相关的 CpG 位点和基因。然而，这些方法依赖于大块组织数据，未能考虑到结直肠组织中固有的细胞异质性，该组织由上皮细胞（如肠细胞、杯状细胞、干细胞）和基质成分混合而成。这种异质性可能会掩盖细胞类型特异性的调节信号并降低统计效能。此外，现有的框架往往缺乏用于优先排序变异以进行基因表达预测的调节上下文。迫切需要描绘细胞类型特异性的表观遗传和转录机制，以更好地理解 CRC 的易感性。

方法论
作者开发了一个基于反卷积信息的细胞类型特异性多组学框架，用于从大块正常结肠组织中推断细胞类型特异性的 DNA 甲基化（DNAm）和基因表达谱。

1. 数据资源：

   • 大块 DNAm： 293 个正常结肠样本（132 个来自 COLONOMICS，161 个来自 GTEx）。
   • 大块基因表达： 707 个正常结肠样本（423 个来自 BarcUVa-Seq，284 个来自 GTEx）。
   • 单细胞参考： 来自 Colorectal Molecular Atlas Project (COLON MAP) 的 scRNA-seq 数据用于表达分析；来自 EpiSCORE DNAm 图谱的甲基化数据用于甲基化分析。
   • GWAS 汇总统计数据： 78,473 例 CRC 病例和 107,143 例欧洲血统对照组。
   • 功能验证： 来自 TCGA、CPTAC、DepMap 以及腺瘤-癌变和锯齿状癌变进展途径的 scRNA-seq 数据。

2. 反卷积与模型构建：

   • 甲基化 (ctMWAS)： 使用 EpiSCORE 框架和张量成分分析 (TCA) 对大块 DNAm 谱进行反卷积，以推断四个上皮细胞类型（肠内分泌细胞、肠细胞、杯状细胞和祖细胞）的 CpG 水平的细胞类型特异性甲基化值。
   • 表达 (ctTWAS)： 使用 CIBERSORTx 对大块 RNA-seq 数据进行反卷积，以估计吸收性（肠细胞）、杯状细胞和干细胞的细胞类型特异性基因表达。
   • 遗传预测模型： 利用弹性网络回归（elastic net regression），作者构建了遗传预测的 DNAm 和基因表达模型。这些模型利用了先前研究中识别出的潜在易感转录因子（TF）占用的调节变异（位于 51 个 CRC 相关 TF 的 1 Mb 范围内）。协变量包括性别、年龄、遗传主成分和 PEER 因子。

3. 关联与整合：

   • 关联测试： 使用 S-PrediXcan 将遗传预测模型与 CRC GWAS 汇总统计数据进行整合。通过元分析（使用聚合 Cauchy 关联测试，ACAT）结合了跨数据集的结果（用于甲基化的 COLONOMICS/GTEx；用于表达的 BarcUVa-Seq/GTEx）。
   • 共定位： 进行分析以识别高置信度的关联，即 DNA 甲基化/基因表达与 CRC 风险共享同一个因果变异（PP.H4 > 0.8）。
   • 功能优先级排序： 通过评估候选基因在 TCGA 中的差异表达一致性、在 DepMap CRISPR 筛选中的必需性，以及在腺瘤-癌变和锯齿状癌变序列中的失调情况（使用 scRNA-seq 数据）来进行功能优先级排序。
   • 通路与药物分析： 使用 Enrichr 进行通路富集。查询药物靶点数据库（DrugBank、ChEMBL 等）以识别具有药物开发潜力的靶点。
   • 实验验证： 在三种 CRC 细胞系（HCT116、RKO、SW480）中对优先排序的基因 SF3A3 进行 siRNA 敲低实验，以评估其对细胞活力、迁移、侵袭和集落形成的影响。

关键结果

• 细胞类型特异性 CpG 位点 (ctMWAS)： 研究识别了 2,341 个显著的细胞类型特异性 CpG-CRC 风险关联（2,134 个唯一位点）。经过共定位过滤后，识别出 178 个高置信度 CpG 位点，分布在 106 个位点（loci）中。值得注意的是，其中 14 个位点是此前 GWAS 中未曾报道过的全新 CRC 易感位点。
• 细胞类型特异性基因 (ctTWAS)： 研究识别了 151 个显著的细胞类型特异性基因-CRC 风险关联（121 个唯一基因）。共定位分析产生了 68 个高置信度关联，对应于 53 个唯一基因。其中 12 个映射到了新的易感位点。
• 多组学整合： 共优先排序了 132 个独特的高置信度风险基因（86 个来自 ctMWAS，53 个来自 ctTWAS，其中 7 个重叠）。
  • 功能支持： 34 个基因在 TCGA 中显示出一致的差异表达；12 个基因在 CPTAC 中显示出一致的蛋白质丰度变化；5 个基因被确定为 DepMap 中细胞生存所必需的基因。
  • 阶段特异性失调： 50 个基因在腺瘤-癌变序列中呈差异表达，44 个基因在锯齿状息肉-癌变序列中呈差异表达，其中 20 个基因在两种途径中均得到支持。
• 通路富集：
  • ctMWAS（肠内分泌细胞）： 富集于同源重组修复 (HRR)、DNA 双链断裂修复 (DSBR) 和 TP53 调节。
  • ctTWAS： 在吸收性/干细胞中富集于 TGF-β 信号传导；在杯状细胞中富集于先天免疫反应、氧化应激和转录重编程。
• 可成药靶点： 在 132 个优先排序的基因中，识别出 14 个与 90 种 FDA 批准或临床阶段药物相关的潜在可成药靶点。其中五个基因（CACNA1I, ERBB2, JAK3, NISCH, TXN）正被目前处于临床评估阶段的 43 种药物所靶向。
• 实验验证： SF3A3 被鉴定为一个收敛性风险基因（在肠细胞和祖细胞中均受到 ctMWAS 和 ctTWAS 的支持）。siRNA 敲低 SF3A3 显著降低了 CRC 细胞系的细胞活力、迁移、侵袭和集落生长能力，支持了其作为癌基因驱动因子的作用。

意义
本文声称，这种基于反卷积的框架能够实现细胞类型解析的、用于识别结直肠癌易感性的表观遗传和转录机制，克服了大块组织分析的局限性。通过整合遗传、表观遗传和转录组数据，该研究提供了更全面的 CRC 遗传架构理解，揭示了 26 个此前未报道的 GWAS 位点和 69 个未报道的风险基因。研究结果为疾病生物学提供了见解，特别是强调了不同上皮细胞类型中截然不同的调节机制（例如，肠内分泌细胞中的 DNA 修复与杯状细胞中的免疫信号传导）。此外，识别出 14 个与现有临床化合物相关的可成药靶点，为 CRC 的预防、治疗开发和药物重定位提供了具有行动力的见解。对 SF3A3 的功能验证进一步支持了该方法在识别新型癌基因驱动因子方面的效用。