Deconvolution-based cell-type specific DNA methylation-wide and transcriptome-wide association studies identify risk CpG sites and genes associated with colorectal cancer risk

Resumo Técnico: Estudos de associação de metilação em todo o DNA e de transcriptoma em todo o genoma baseados em desconvolução, específicos para tipos celulares, identificam sítios CpG e genes de risco associados ao câncer colorretal

Definição do Problema
Estudos de associação de metilação em todo o DNA (MWAS) e de transcriptoma em todo o genoma (TWAS) baseados em tecidos totais (bulk) convencionais identificaram com sucesso inúmeros sítios CpG e genes associados ao risco de câncer colorretal (CCR). No entanto, essas abordagens dependem de dados de tecido total que não consideram a heterogeneidade celular inerente aos tecidos do cólon, que compreendem misturas de células epiteliais (ex: enterócitos, células caliciformes, células-tronco) e componentes estromais. Essa heterogeneidade pode obscurecer sinais regulatórios específicos de cada tipo celular e reduzir o poder estatístico. Além disso, as estruturas existentes carecem frequentemente do contexto regulatório necessário para priorizar variantes para a predição da expressão gênica. Há uma necessidade crítica de delinear mecanismos epigenéticos e transcricionais específicos de tipos celulares para melhor compreender a suscetibilidade ao CCR.

Metodologia
Os autores desenvolveram uma estrutura de multi-ômica informada por desconvolução para inferir perfis de metilação do DNA (DNAm) e de expressão gênica específicos de tipos celulares a partir de tecidos normais do cólon em massa.

1. Recursos de Dados:

   • DNAm Total (Bulk): 293 amostras normais de cólon (132 do COLONOMICS; 161 do GTEx).
   • Expressão Gênica Total (Bulk): 707 amostras normais de cólon (423 do BarcUVa-Seq; 284 do GTEx).
   • Referências de Célula Única (Single-Cell): Dados de scRNA-seq do projeto Colorectal Molecular Atlas (COLON MAP) para expressão; atlas de metilação EpiSCORE para metilação.
   • Estatísticas de Resumo de GWAS: 78.473 casos de CCR e 107.143 controles de ancestralidade europeia.
   • Validação Funcional: Dados de TCGA, CPTAC, DepMap e scRNA-seq das vias de progressão de adenoma-carcinoma e carcinoma serrilhado.

2. Desconvolução e Construção do Modelo:

   • Metilação (ctMWAS): Os perfis de DNAm total foram desconvoluídos usando a estrutura EpiSCORE e Análise de Composição de Tensor (TCA) para inferir valores de metilação em nível de CpG e específicos de tipo celular para quatro tipos de células epiteliais: enteroendócrinas, enterócitos, células caliciformes e células progenitoras.
   • Expressão (ctTWAS): Dados de RNA-seq total foram desconvoluídos usando CIBERSORTx para estimar a expressão gênica específica de tipo celular para células absortivas (enterócitos), caliciformes e células-tronco.
   • Modelos de Predição Genética: Usando regressão elastic net, os autores construíram modelos de DNAm e expressão gênica geneticamente preditos. Esses modelos utilizaram variantes regulatórias supostamente ocupadas por fatores de transcrição (TF) suscetíveis (dentro de 1 Mb de 51 TFs associados ao CCR) identificadas em trabalhos anteriores. As covariáveis incluíram sexo, idade, componentes principais genéticos e fatores PEER.

3. Associação e Integração:

   • Teste de Associação: O S-PrediXcan foi usado para integrar os modelos geneticamente preditos com as estatísticas de resumo de GWAS de CCR. A meta-análise (usando o Teste de Associação Cauchy Agregado, ACAT) combinou os resultados entre os conjuntos de dados (COLONOMICS/GTEx para metilação; BarcUVa-Seq/GTEx para expressão).
   • Colocalização: Análises foram realizadas para identificar associações de alta confiança onde a metilação do DNA/expressão gênica e o risco de CCR compartilham uma variante causal (PP.H4 > 0,8).
   • Priorização Funcional: Genes candidatos foram avaliados quanto à concordância com a expressão diferencial em TCGA, essencialidade em telas CRISPR de DepMap e desregulação ao longo das sequências de adenoma-carcinoma e serrado-carcinoma usando dados de scRNA-seq.
   • Análise de Via e Fármacos: O Enrichr foi usado para enriquecimento de vias. Bancos de dados de alvos terapêuticos (DrugBank, ChEMBL, etc.) foram consultados para identificar alvos druggable (medicáveis).
   • Validação Experimental: O nocaute por siRNA do gene priorizado SF3A3 foi realizado em três linhagens celulares de CCR (HCT116, RKO, SW480) para avaliar viabilidade, migração, invasão e formação de colônias.

Principais Resultados

• Sítios CpG Específicos de Tipo Celular (ctMWAS): O estudo identificou 2.341 associações significativas de risco de CpG específicos de tipo celular (2.134 sítios únicos). Após o filtro de colocalização, 178 sítios CpG de alta confiança foram identificados em 106 loci. Notavelmente, 14 desses loci eram loci de suscetibilidade ao CCR inéditos, não relatados anteriormente em GWAS.
• Genes Específicos de Tipo Celular (ctTWAS): O estudo identificou 151 associações significativas de risco de gene específico de tipo celular (121 genes únicos). A análise de colocalização resultou em 68 associações de alta confiança correspondentes a 53 genes únicos. 12 deles mapearam para loci de suscetibilidade inéditos.
• Integração Multi-ômica: Um total de 132 genes de risco únicos de alta confiança foram priorizados (86 de ctMWAS, 53 de ctTWAS, com 7 sobreposições).
  • Suporte Funcional: 34 genes mostraram concordância de expressão diferencial no TCGA; 12 mostraram mudanças concordantes na abundância de proteínas no CPTAC; 5 foram identificados como essenciais para a viabilidade celular no DepMap.
  • Desregulação por Estágio: 50 genes foram expressos diferencialmente ao longo da sequência adenoma-carcinoma, e 44 ao longo da sequência pólipo-serrilhado-carcinoma, com 20 genes suportados por ambas as vias.
• Enriquecimento de Vias:
  • ctMWAS (Células Enteroendócrinas): Enriquecido em recombinação homóloga (HRR), reparo de quebra de fita dupla de DNA (DSBR) e regulação de TP53.
  • ctTWAS: Enriquecido em sinalização de TGF-β (células absortivas/tronco) e respostas imunes inatas, estresse oxidativo e reprogramação transcricional (células caliciformes).
• Alvos Medicáveis (Druggable Targets): 14 dos 132 genes priorizados foram identificados como potenciais alvos medicáveis ligados a 90 drogas aprovadas pelo FDA ou em estágio clínico. Cinco genes (CACNA1I, ERBB2, JAK3, NISCH, TXN) foram alvo de 43 drogas atualmente em avaliação clínica.
• Validação Experimental: O nocaute por siRNA de SF3A3 foi identificado como um gene de risco convergente (suportado tanto por ctMWAS quanto por ctTWAS em enterócitos e células progenitoras). O nocaute de SF3A3 reduziu significativamente a viabilidade celular, migração, invasão e crescimento clonogênico em linhagens celulares de CCR, apoiando seu papel como um driver oncogênico.

Significância
O artigo afirma que esta estrutura informada por desconvolução permite a identificação resolvida por tipo celular de mecanismos epigenéticos e transcricionais subjacentes à suscetibilidade ao CCR, superando as limitações das análises de tecido total. Ao integrar dados genéticos, epigenéticos e transcriptômicos, o estudo fornece uma compreensão mais abrangente da arquitetura genética do CCR, revelando 26 loci de GWAS anteriormente não relatados e 69 genes de risco não relatados. As descobertas oferecem insights sobre a biologia da doença, especificamente destacando mecanismos regulatórios distintos em diferentes tipos de células epiteliais (ex: reparo de DNA em células enteroendócrinas vs. sinalização imune em células caliciformes). Além disso, a identificação de 14 alvos medicáveis ligados a compostos clínicos existentes fornece insights acionáveis para a prevenção do CCR, desenvolvimento terapêutico e reposicionamento de fármacos. A validação funcional de SF3A3 apoia adicionalmente a utilidade desta abordagem na identificação de novos drivers oncogênicos.