Effects of concentrate supplementation on fecal microbiota, serum metabolomics, and proteomics in grazing Yili horses

技术摘要：浓缩饲料补充对放牧伊犁马粪便微生物群、血清代谢组学及蛋白质组学的影响

问题陈述
作为中国的一种兼用型品种，伊犁马依赖自然放牧，而自然放牧受季节性波动和降水变化的影响，可能导致牧草质量和营养可用性下降。虽然天然牧场提供粗饲料，但可能无法满足泌乳早期母马特定的能量和蛋白质需求，从而限制了健康管理和母马奶资源的开发。尽管浓缩饲料补充是解决营养缺口的一种已知策略，但目前仍缺乏整合研究来探讨此类补充如何影响放牧马类后肠发酵、微生物群落结构以及宿主全身代谢（代谢组学和蛋白质组学）之间复杂的相互作用。

研究方法
本研究采用了一个为期100天的对照实验（10天适应期，90天试验期），将16匹处于泌乳早期的伊犁母马（3–4岁，约391.5 kg）随机分为两组：

• 放牧组 (G)： 在天然牧场上自然放牧。
• 放牧+补充组 (GS)： 在自然放牧的基础上，每日摄入2 kg配方浓缩饲料补充剂（含52%玉米、20%豆粕、12%麸皮、10%大麦以及矿物质/维生素）。

数据收集与分析：

• 样本： 在第90天收集粪便样本（用于测定发酵参数、pH值和16S rRNA测序）和血液样本（用于生化指标、代谢组学和蛋白质组学分析）。
• 粪便分析： 通过气相色谱法测量挥发性脂肪酸 (VFAs)，并通过PacBio全长16S rRNA测序评估微生物多样性。
• 血清分析：
  • 生化指标： 使用自动分析仪检测葡萄糖、脂质、肝酶和胆红素。
  • 代谢组学： 采用非靶向UPLC-MS/MS（ESI+ 和 ESI-）鉴定血清代谢物。
  • 蛋白质组学： 使用基于DIA的LC-MS/MS (Orbitrap Astral) 定量血清蛋白。
• 统计学： 生化数据采用独立t检验；代谢组学采用OPLS-DA；微生物组采用LEfSe；并通过相关性分析（Spearman）将微生物群、发酵产物、代谢物和蛋白质联系起来。

关键结果

• 粪便发酵与微生物群：

  • 与G组相比，GS组表现出显著更高的粪便丙酸和丁酸浓度、较低的粪便pH值以及较低的乙酸丙酸比。
  • 微生物多样性（Simpson指数）在GS组中更高。
  • 属水平的变化： GS组中Treponema（链弹状螺旋体属）和Oliverpabstia的相对丰度显著升高，而G组中Lachnoclostridium、Roseburia、Anaerosacchariphilus和Coprococcus的丰度较高。
  • 相关性分析表明，Treponema与丁酸呈正相关，与pH值呈负相关，而纤维降解属（如Lachnoclostridium、Roseburia）与补充组中的发酵产物呈负相关。

• 血清生化指标：

  • 浓缩饲料补充显著提高了血清葡萄糖 (GLU) 水平。
  • 显著降低了总胆红素 (TBIL)、总胆固醇 (TC) 和高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)。
  • 其他指标（如尿素、ALT、AST或甘油三酯）未发现显著差异。

• 血清代谢组学：

  • 共鉴定出487种差异代谢物（GS组中上调78种，下调409种）。
  • KEGG富集分析突出了与三羧酸 (TCA) 循环、核苷酸代谢、胆汁分泌、维生素B6代谢和丙酮酸代谢相关的通路。
  • GS组中特异性增加的物质包括雌酮-3-硫酸盐、富马酸、尿酸和柠檬酸；减少的物质包括顺式-乌头酸、肌苷和鸟嘌呤。

• 血清蛋白质组学：

  • 共鉴定出31种差异表达蛋白 (DEPs)（GS组中上调20种，下调11种）。
  • 上调蛋白： Peroxiredoxin-5 (PRDX5)、lactoylglutathione lyase (GLO1)、转酮酶、ATP1A1 以及多种免疫相关蛋白（如免疫球蛋白轻链片段、α-1抗胰蛋白酶）。
  • 下调蛋白： 磷脂转移蛋白、膜联蛋白、激肽相关肽酶11 以及特定的免疫球蛋白片段。
  • 功能富集指向代谢过程、细胞对刺激的反应以及免疫系统过程，特别涉及丙酮酸代谢和磷酸戊糖途径。

主要贡献
本研究从多组学角度阐明了浓缩饲料补充如何改变放牧伊犁马的生理状态。通过整合粪便微生物群、发酵参数、血清代谢组学和蛋白质组学，该研究阐明了膳食淀粉摄入与宿主代谢适应之间的机制联系。研究表明，补充饲料使后肠发酵向丙酸和丁酸生产转变，并调节血清谱以增强葡萄糖可用性和抗氧化能力，同时改变了脂质和胆汁酸代谢。

意义与结论
作者得出结论，适度的浓缩饲料补充（2 kg/天）能有效改变放牧伊犁马的粪便发酵模式和微生物组成。研究声称，这些饮食变化调节了与血清葡萄糖和脂质代谢、胆汁酸代谢、抗氧化反应及能量代谢相关的通路。具体而言，抗氧化蛋白（PRDX5、GLO1）和参与磷酸戊糖途径的酶的上调，表明其增强了代谢缓冲和解毒能力。

本文认为，这些发现表明适度的浓缩饲料补充可能改善放牧伊犁马（尤其是泌乳期）的营养和代谢状态。该研究旨在为精准营养管理和饲喂策略提供理论依据，以优化马匹健康并维持草原生态稳定性。作者明确指出，虽然Treponema的丰度有所增加（该属有时与炎症相关），但由于研究未进行组织学测量，因此对这一潜在风险持谨慎态度。