Effects of concentrate supplementation on fecal microbiota, serum metabolomics, and proteomics in grazing Yili horses

技術要約：放牧中の伊犁馬における濃厚飼料補給が糞便微生物叢、血清メタボロミクス、およびプロテオミクスに及ぼす影響

問題提起
中国の二目的利用品種である伊犁馬は、自然放牧に依存しているが、これは季節変動や降水量の変化の影響を受けやすく、牧草の品質や栄養可用性が損なわれる可能性がある。天然牧草は粗飼料を提供するものの、泌乳初期の牝馬における特定のエネルギーおよびタンパク質要求量を満たせない場合があり、それが健康管理や牝馬乳資源の開発を制限する可能性がある。濃厚飼料の補給は栄養ギャップを埋めるための既知の戦略であるが、放牧中の馬における後腸発酵、微生物コミュニティ構造、および宿主の全身代謝（メタボロミクスおよびプロテオミクス）の間の複雑な相互作用を調査した統合的な研究は不足している。

研究手法
本研究では、16頭の泌乳初期の伊犁馬（3〜4歳、体重約391.5 kg）を対象とした、制御された100日間の実験（10日間の順応期間、90日間の試験期間）を実施した。個体は以下の2群にランダムに割り当てられた：

• 放牧群 (G): 天然牧草による放牧。
• 放牧＋濃厚飼料補給群 (GS): 天然放牧に加え、調合された濃厚飼料補給剤（トウモロコシ52%、大豆ミール20%、ふすま12%、大麦10%、およびミネラル・ビタミン類）を1日2 kg摂取。

データ収集および分析：

• 試料: 糞便試料（発酵パラメータ、pH、および16S rRNAシーケンシング用）および血液試料（生化学的指標、メタボロミクス、およびプロテオミクス用）を90日目に採取した。
• 糞便分析: ガスクロマトグラフィーによる揮発性脂肪酸（VFA）の測定、およびPacBioフルレングス16S rRNAシーケンシングによる微生物多様性の評価を行った。
• 血清分析:
  • 生化学: 自動分析装置を用いてグルコース、脂質、肝酵素、およびビリルビンを測定。
  • メタボロミクス: 非標的型UPLC-MS/MS（ESI+およびESI-）を用いて血清代謝物を同定。
  • プロテオミクス: DIAベースのLC-MS/MS（Orbitrap Astral）を用いて血清タンパク質を定量。
• 統計学: 生化学データには独立t検定、メタボロミクスにはOPLS-DA、微生物叢にはLEfSeを用い、微生物叢、発酵、代謝物、およびタンパク質を関連付けるために相関分析（Spearman）を実施した。

主な結果

• 糞便発酵および微生物叢:

  • GS群はG群と比較して、糞便中のプロピオン酸および酪酸濃度が有意に高く、糞便pHおよび酢酸・プロピオン酸比が低かった。
  • 微生物の多様性（Simpson指数）はGS群で高かった。
  • 属レベルの変化: GS群ではTreponemaおよびOliverpabstiaの相対存在量が有意に増加し、G群ではLachnoclostridium、Roseburia、Anaerosacchariphilus、およびCoprococcusの存在量が高かった。
  • 相関分析により、Treponemaは酪酸と正の相関があり、pHと負の相関があることが示された。一方、繊維分解属（Lachnoclostridium、Roseburia）は、補給群における発酵生成物と負の相関を示した。

• 血清生化学:

  • 濃厚飼料の補給は、血清グルコース（GLU）を有意に増加させた。
  • また、総ビリルビン（TBIL）、総コレステロール（TC）、および高密度リポタンパク質コレステロール（HDL-C）を有意に減少させた。
  • 尿素、ALT、AST、またはトリグリセリドなどの他の指標には有意な差は見られなかった。

• 血清メタボロミクス:

  • 487個の示差的代謝物が同定された（GS群においてアップレギュレートされたものが78個、ダウンレギュレートされたものが409個）。
  • KEGG濃縮解析により、トリカルボン酸（TCA）サイクル、ヌクレオチド代謝、胆汁分泌、ビタミンB6代謝、およびピルビン酸代謝に関連する経路が強調された。
  • GS群における具体的な増加項目には、エストロン-3-硫酸、フマル酸、尿酸、およびクエン酸が含まれる。減少項目には、シスアコニト酸、イノシン、およびグアニンが含まれる。

• 血清プロテオミクス:

  • 31個の示差的発現タンパク質（DEP）（GS群でアップレギュレートされたものが20個、ダウンレギュレートされたものが11個）が同定された。
  • アップレギュレート: ペルオキシレドキシン-5（PRDX5）、ラクトイルグルタチオンリアーゼ（GLO1）、トランスケトラーゼ、ATP1A1、およびいくつかの免疫関連タンパク質（例：免疫グロブリン軽鎖断片、α1-アンチトリプシン）。
  • ダウンレギュレート: リン脂質転送タンパク質、アネキシン、カリクレイン関連ペプチダーゼ11、および特定の免疫グロブリン断片。
  • 機能濃縮解析は、ピルビン酸代謝およびペントースリン酸経路に特化した、代謝プロセス、刺激に対する細胞応答、および免疫系プロセスに関与することを示した。

主要な貢献
本研究は、マルチオミクスの視点から、濃厚飼料の補給が放牧中の伊犁馬の生理学的状態をどのように変化させるかを明らかにしている。糞便微生物叢、発酵パラメータ、血清メタボロミクス、およびプロテオミクスを統合することにより、本研究は、デンプン摂取量と宿主の代謝適応の間のメカニズム的なつながりを解明している。本研究は、補給によって後腸発酵がプロピオン酸および酪酸の生成へとシフトし、血清プロファイルを調整することで、グルコースの利用能を高め、抗酸化能を向上させると同時に、脂質および胆汁酸代謝を変化させることを実証している。

意義および主張
著者らは、適度な濃厚飼料の補給（1日2 kg）が、放牧中の伊犁馬における糞便発酵パターンおよび微生物組成を効果的に変化させると結論付けている。本研究は、これらの食事の変化が、血清グルコースおよび脂質代謝、胆汁酸代謝、抗酸化応答、およびエネルギー代謝に関連する経路を調節することを主張している。具体的には、抗酸化タンパク質（PRDX5、GLO1）およびペントースリン酸経路に関与する酵素のアップレギュレーションは、代謝バッファリングおよび解毒能力の向上を示唆している。

本研究の結果は、適度な濃厚飼料の補給が、特に泌乳期における放牧中の伊犁馬の栄養および代謝状態を改善する可能性があることを示唆している。本研究は、馬の健康を維持しつつ草原の生態学的安定性を保つための、精密な栄養管理および給餌戦略を最適化するための理論的根拠を提供することを目的としている。著者らは、Treponemaの存在量が増加していること（この属は炎症に関連する場合がある）に触れ、組織学的な変化は測定していないため、この潜在的なリスクについては注意深く言及している。