Single-cell analysis of pre-rRNA in Escherichia coli indicates distinct pathways of action for YbeX and YbeY proteins in ribosome biogenesis

技术摘要：单细胞分析显示大肠杆菌中 YbeX 和 YbeY 蛋白在核糖体生物发生中具有不同的作用途径

问题陈述
大肠杆菌（Escherichia coli）中的 YbeX（也称为 CorC）和 YbeY 蛋白编码在同一个操纵子（ybeZYX-lnt）中，两者均与核糖体生物发生有关。虽然 YbeY 已被确立为 16S rRNA 成熟的因子，但 YbeX 的具体功能尚不明确。先前的群体水平研究表明，缺失 ybeX ($\Delta$ybeX) 会导致 17S pre-rRNA 和 16S rRNA 降解中间体的积累，尤其是在镁离子（Mg$^{2+}$）限制条件下。该表型伴随着从平台期重新生长时的延迟期延长以及菌落大小的异质性，这表明存在细胞间的差异性。然而，群体测量无法区分这些缺陷是代表全细胞范围内的均匀受损，还是仅限于特定亚群的严重缺陷。此外，目前尚不清楚 YbeX 和 YbeY 是通过相同还是不同的机制干扰核糖体代谢。

方法论
为了在单细胞分辨率下解决这些问题，作者采用了结合流式细胞术的 rRNA 荧光原位杂交技术（rRNA-FISH-flow）。

• 菌株： 使用了等基因的大肠杆菌 BW25113（野生型，WT）、$\Delta$ybeX 和 $\Delta$ybeY 菌株。
• 生长条件：
  • $\Delta$ybeX 和 WT 在含有 Mg$^{2+}$ 限制（50 $\mu$M MgCl$_2$）的 MOPS 最低培养基中生长，以诱导特定表型。实验包含两个阶段：(1) 生长至对数后期以积累 pre-rRNA；(2) 从平台期重新生长以观察清除情况。
  • $\Delta$ybeY 和 WT 在富集的 LB 培养基中生长，因为 $\Delta$ybeY 表现出与 Mg$^{2+}$ 限制无关的组成型生长缺陷。
• FISH-Flow 方案： 将细胞固定、用乙醇通透化，并使用针对 16S rRNA、23S rRNA 和 17S pre-rRNA 的 Cy3 和 Cy5 标记 DNA 寡核苷酸探针进行杂交。使用 DAPI 染色以排除非细胞颗粒。
• 分析： 流式细胞术（BD LSR Fortessa）定量单个细胞的荧光信号。数据分析侧重于中值信号强度、四分位距（细胞间变化）以及 rRNA 物种与 DNA 含量之间的 Pearson 相关系数。作者专门分析了具有最高 17S pre-rRNA 信号的前 10% 细胞，以评估极端表型。

核心贡献与结果

1. $\Delta$ybeX 与 $\Delta$ybeY 的不同单细胞特征：

   • $\Delta$ybeX（Mg$^{2+}$ 依赖型，异质性）： 在 Mg$^{2+}$ 限制下，$\Delta$ybeX 细胞表现出显著的、随时间变化的 17S pre-rRNA 分布拓宽。在向平台期过渡的过程中，17S 水平的细胞间变化从约 5 倍增加到约 25 倍。在从平台期重新生长时，群体呈现出 双峰分布 的 17S pre-rRNA。出现了两个截然不同的亚群：一个保留高水平的未加工 pre-rRNA，另一个则处于低水平。只有当这些亚群达到近似相等的比例时，可见的生长才得以恢复，这表明延迟期是由“高 17S”亚群清除中间体所需的时间驱动的。
   • $\Delta$ybeY（组成型，均匀性）： 相比之下，$\Delta$ybeY 细胞在富集 LB 培养基的对数生长期早期，在整个群体中均匀地积累 17S pre-rRNA。其分布保持窄而单峰（比 WT 高约 8 倍），表明存在一个直接的、组成型的缺陷，影响所有细胞，这与 YbeY 已知的 16S 3' 端成熟作用一致。

2. 化学计量学与稳态：

   • 在两种突变体中，成熟 16S 和 23S rRNA 之间的化学计量关系保持紧密相关且平衡，与野生型相似。这表明 rRNA 操纵子的转录和成熟亚基的组装并未受到普遍破坏。
   • $\Delta$ybeX 的缺陷特异于 pre-rRNA 加工。17S pre-rRNA 与成熟 16S rRNA 之间的相关性在 $\Delta$ybeX 中较弱，并随生长阶段而变化，特别是在重新生长实验的清除阶段出现了失衡。

3. 时间解耦：

   • 在 $\Delta$ybeX 中，17S pre-rRNA 的积累始于对数中期，但生长速率在数小时内与 WT 保持一致。生长停滞仅发生在对数后期/平台期转换期间。这表明 17S 积累并非立即限制翻译，而是必须跨越一个阈值（例如，成熟亚基与不成熟亚基的比率或 Mg$^{2+}$ 辅因子耗尽）才会触发延迟期。

意义与主张
本文声称，单细胞分析揭示了 YbeX 和 YbeY 通过性质截然不同的机制影响核糖体 RNA 代谢：

• YbeY 通过直接的生化机制（可能是酶促加工）发挥作用，导致均匀的、全群体性的缺陷。
• YbeX 通过间接机制发挥作用，可能与细胞内 Mg$^{2+}$ 稳态有关（与其 CorC 结构域一致）。该缺陷仅在 Mg$^{2+}$ 限制下显现，且仅存在于部分细胞中，从而导致表型异质性和双稳态。

作者得出结论，$\Delta$ybeX 延长的延迟期是由单个细胞中 pre-ribosomal 中间体的异质性清除引起的，而非均匀的减速。这项工作提供了一个框架，用于区分直接的酶促损伤与间接的生理缺陷，并指出细胞间异质性可以作为识别底层作用机制的诊断标志。该研究并未最终解决 YbeX 是直接的 Mg$^{2+}$ 传感器调节转录，还是在低 Mg$^{2+}$ 条件下驱动组装的因子，并指出需要动力学实验和单细胞 Mg$^{2+}$ 测量来进行进一步解析。