Single-cell analysis of pre-rRNA in Escherichia coli indicates distinct pathways of action for YbeX and YbeY proteins in ribosome biogenesis

기술 요약: Escherichia coli 내 pre-rRNA의 단일 세포 분석은 YbeX 및 YbeY 단백질의 서로 다른 작용 경로를 나타낸다

문제 제기
Escherichia coli 단백질인 YbeX(CorC로도 알려짐)와 YbeY는 동일한 오페론(ybeZYX-lnt)에 인코딩되어 있으며, 둘 다 리보솜 생합성에 관여하는 것으로 알려져 있다. YbeY는 16S rRNA 성숙의 인자로 확립되어 있는 반면, YbeX의 구체적인 기능은 여전히 불분명하다. 기존의 벌크 수준 연구들은 ybeX 결실($\Delta$ybeX)이 마그네슘(Mg$^{2+}$) 제한 조건, 특히 마그네슘이 부족할 때 17S pre-rRNA 및 16S rRNA 분해 중간체의 축적을 초래한다는 것을 보여주었다. 이러한 표현형은 정지기(stationary phase)로부터 재성장 시 연장된 지체기(lag phase)와 이질적인 콜로니 크기를 동반하며, 이는 세포 간 변동성을 시사한다. 그러나 벌크 측정법으로는 이러한 결함이 모든 세포에 균일하게 나타나는 기능 저하인지, 아니면 특정 하위 집단에 국한된 심각한 결함인지를 구분할 수 없다. 또한, YbeX와 YbeY가 동일한 메커니즘을 통해 리보솜 대사를 교란하는지, 아니면 서로 다른 메커니즘을 통해 교란하는지도 알려져 있지 않다.

방법론
저자들은 단일 세포 해상도에서 이 질문들을 해결하기 위해 rRNA 형광 in situ 하이브리드화 및 유세포 분석(rRNA-FISH-flow) 기법을 사용하였다.

• 균주: 등이성(isogenic) E. coli BW25113 (야생형, WT), $\Delta$ybeX, 그리고 $\Delta$ybeY 균주를 활용하였다.
• 배양 조건:
  • $\Delta$ybeX와 WT는 특정 표현형을 유도하기 위해 Mg$^{2+}$ 제한(50 $\mu$M MgCl$_2$)이 있는 MOPS 최소 배지에서 배양되었다. 실험은 두 단계로 진행되었다: (1) pre-rRNA를 축적시키기 위한 후기 지수 성장기까지의 배양, (2) 정지기로부터의 재성장을 관찰하기 위한 배양.
  • $\Delta$ybeY와 WT는 풍부한 LB 배지에서 배양되었는데, 이는 $\Delta$ybeY가 Mg$^{2+}$ 제한과 무관하게 구성적인 성장 결함을 보이기 때문이다.
• FISH-Flow 프로토콜: 세포를 고정하고 에탄올로 투과화한 후, 16S rRNA, 23S rRNA, 그리고 17S pre-rRNA를 표적으로 하는 Cy3 및 Cy5 표지 DNA 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화하였다. 비세포성 입자를 제외하기 위해 DAPI 염색을 사용하였다.
• 분석: 유세포 분석기(BD LSR Fortessa)를 통해 개별 세포의 형광 신호를 정량화하였다. 데이터 분석은 중앙값 신호 강도, 사분위 범위(세포 간 변동성), 그리고 rRNA 종과 DNA 함량 사이의 피어슨 상관 계수에 초점을 맞추었다. 저자들은 극단적인 표현형을 평가하기 위해 17S pre-rRNA 신호가 가장 높은 상위 10%의 세포를 구체적으로 분석하였다.

주요 기여 및 결과

1. $\Delta$ybeX와 $\Delta$ybeY의 구별되는 단일 세포 시그니처:

   • $\Delta$ybeX (Mg$^{2+}$ 의존적, 이질적): Mg$^{2+}$ 제한 조건에서 $\Delta$ybeX 세포는 17S pre-rRNA 분포의 현저하고 시간 의존적인 확장을 보였다. 정지기로 전환되는 동안, 17S 수준의 세포 간 변동성은 약 5배에서 약 25배로 증가했다. 정지기로부터 재성장할 때, 집단은 17S pre-rRNA의 **이봉 분포(bimodal distribution)**를 나타냈다. 미처리된 pre-rRNA를 높게 보유한 하위 집단과 낮은 수준을 가진 하위 집단이라는 두 개의 뚜렷한 하위 집단이 출현했다. 가시적인 성장은 이 하위 집단들이 대략적으로 같은 비율에 도arm했을 때만 재개되었으며, 이는 지체기가 "높은-17S" 하위 집단이 중간체를 제거하는 데 필요한 시간에 의해 유도됨을 시사한다.
   • $\Delta$ybeY (구성적, 균일적): 이와 대조적으로, $\Delta$ybeY 세포는 풍부한 배지에서의 초기 지수 성장기 동안 집단 전체에 걸쳐 균일하게 17S pre-rRNA를 축적했다. 분포는 좁고 단봉형(unimodal)을 유지하였으며(WT보다 약 8배 높음), 이는 모든 세포에 유사하게 영향을 미치는 직접적이고 구성적인 결함을 나타내며, 이는 16S 3'-말단 성숙에서의 YbeY의 알려진 역할과 일치한다.

2. 화학량론 및 항상성:

   • 두 돌연변이 모두에서 성숙한 16S 및 23S rRNA 사이의 화학량론은 야생형과 유사하게 긴밀하게 상관되어 있고 균형을 이루고 있었다. 이는 rRNA 오페론의 전사와 성숙한 소단위체의 조립이 일반적으로 방해받지 않음을 나타낸다.
   • $\Delta$ybeX의 결함은 pre-rRNA 가공에 특이적이다. 17S pre-rRNA와 성숙한 16S rRNA 사이의 상관관계는 $\Delta$ybeX에서 더 약했으며, 특히 재성장 실험의 제거 단계 동안 변화하며 무너졌다.

3. 시간적 디커플링(Temporal Decoupling):

   • $\Delta$ybeX에서 17S pre-rRNA의 축적은 중기 지수 성장기부터 시작되었으나, 성장률은 몇 시간 동안 WT와 구별되지 않았다. 성장 정지는 후기 지수 성장기/정지기 전환 시점에 발생했다. 이는 17S 축적이 즉각적으로 번역을 제한하는 것이 아니라, 어떤 임계값(예: 성숙한 소단위체와 미성숙한 소단위체의 비율 또는 Mg$^{2+}$ 보조인자 고갈)을 넘어야 지체기를 유발하는 트리거가 작동함을 시사한다.

의의 및 주장
본 논문은 단일 세포 분석을 통해 YbeX와 YbeY가 질적으로 구별되는 메커니즘을 통해 리보솜 RNA 대사에 영향을 미친다는 점을 주장한다.

• YbeY는 직접적인 생화학적 메커니즘(아마도 효소적 가공)을 통해 작용하여, 집단 전체에 균일한 결함을 초래한다.
• YbeX는 간접적인 메커니즘(그의 CorC 도메인과 일치하는 Mg$^{2+}$ 항상성과 관련된 것으로 추정)을 통해 작용한다. 이 결함은 Mg$^{2+}$ 제한 하에서만 나타나며 특정 세포 집단에서만 나타나, 표현형의 이질성과 이중 안정성(bistability)을 유발한다.

저자들은 $\Delta$ybeX의 연장된 지체기가 균일한 속도 저하가 아니라 개별 세포에서의 이질적인 pre-리보솜 중간체 제거에 의해 발생한다고 결론지었다. 이 연구는 직접적인 효소적 병변과 간접적인 생리적 결함을 구분하는 프레임워크를 제공하며, 세포 간 변동성이 기저의 작용 메커니즘을 진단하는 지표로 쓰일 수 있음을 시사한다. 본 연구는 YbeX가 Mg$^{2+}$를 직접 감지하여 전사를 조절하는 센서인지, 아니면 저농도 Mg$^{2+}$ 환경에서 조립을 유도하는 인자인지를 명확히 규명하지는 못했으나, 이를 추가로 해결하기 위해서는 속도론적 실험과 단일 세포 Mg$^{2+}$ 측정이 필요하다고 언급하였다.