Brain and blood DNA methylation profiling in Machado-Joseph disease (MJD)/spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3)

技术摘要：马达豆病（MJD）/ 脊髓小脑性共济失调 3 型（SCA3）中的脑部与血液 DNA 甲基化图谱分析

问题陈述
马达豆病（MJD），或称脊髓小脑性共济失调 3 型（SCA3），是一种由 ATXN3 基因中 CAG 重复序列扩增引起的遗传性神经退行性疾病。尽管该病具有单基因遗传特性，但其临床和神经病理学表现出显著的异质性，包括发病年龄的广泛差异，而这种差异仅能由 CAG 重复序列长度部分解释。这表明存在表观遗传修饰因子的参与。先前的研究已发现 ATXN3 启动子中特定 CpG 位点与发病年龄之间存在有限的关联，以及全局性的甲基化变化，但仍缺乏对疾病相关组织（脑部和血液）以及疾病阶段（临床前期 vs. 有症状期）中 DNA 甲基化改变的全基因组范围的全面理解。此外，外周血甲基化模式是否可以作为脑特异性表观遗传变化的替代指标，或者能否定义一种独特的疾病“表观特征（episignature）”，目前尚不明确。

方法学
本研究采用多组织、全基因组 DNA 甲基化图谱分析方法，使用 Infinium Human Methylation EPIC BeadChip v1.0 芯片。

• 脑组织： 对 6 例 MJD 患者和 6 例年龄及性别匹配的对照组进行的死后冷冻样本进行分析。每个捐赠者检查了两个不同的区域：齿状核（DN，受 MJD 严重影响的区域）和大脑皮层（CC，病理相对较轻的区域）。
• 外周血： 收集了 24 例杂合 MJD 突变携带者（17 例有症状患者和 7 例临床前期携带者）和 24 例匹配对照组的横断面数据。
• 分析流程：
  • 差异分析： 使用 limma 进行差异甲基化位点（DMPs）的识别，并采用 Benjamini-Hochfeld 校正（FDR < 0.05）。使用 mCSEA 包检测差异甲基化区域（DMRs），要求至少包含 5 个 CpG 位点，且 FDR < 0.05，绝对平均 beta 差异 > 0.05。
  • 功能注释： 使用 GREAT 进行基因本体论（GO）富集分析，并使用 HOMER 进行转录因子（TF）结合基序富集分析。
  • 表观特征发现： 使用一个包含 15 个患者血液样本的子集，尝试通过使用针对 EpiSign™ 知识库中的对照组进行训练的机器学习流水线（SVM）来发现独特的 MJD 表观特征。
  • 临床相关性： 通过线性回归评估甲基化水平与临床变量（CAG 重复长度、发病年龄、病程、SARA 评分）之间的关联。使用 Horvath 全组织时钟计算表观遗传年龄加速。

关键结果

• 脑部甲基化景观：

  • CpG 水平： 在单个 CpG 水平上的改变极小，在两个脑区中仅检测到三个显著的 DMPs（其中一个位于 INTS1）。
  • 区域水平（DMRs）： 与单个位点相比，在两个脑区中检测到了 175 个 DMRs。DN（受严重影响）包含 44 个 DMRs，而 CC（受影响较轻）包含 131 个 DMRs。DN 和 CC 之间共有 8 个 DMRs。
  • 功能富集： DN 未显示显著的 GO 富集。然而，CC 中的高甲基化 DMRs 强烈富集于髓鞘形成相关的通路（例如 MAG、MOBP、PLLP、MYRF）。
  • 转录因子： CC 中的 TF 基序分析显示出 SOX 家族基序（与少突胶质细胞谱系相关）的富集，而 DN 则显示出 ETS 家族基序（与炎症/应激相关）和 PR 基序的富集。
  • ATXN3 位点： 在两个脑区的 ATXN3 基因内均未发现 DMRs 或 DMPs。

• 血液甲基化景观：

  • CpG 水平： 在血液中未检测到全基因组显著的 DMPs，这与缺乏独特 MJD 表观特征的结果一致。
  • 区域水平： 在血液中识别出了 DMRs，但临床前期携带者的 DMRs（30 个）比有症状患者（14 个）更多。仅有一个 DMR（在 CYP2E1 中）在临床前期和有症状组之间重叠。
  • 组织重叠： 血液中的 DMRs 与 DN 或 CC 中识别出的 DMRs 均无重叠，表明在终末期疾病中，血液甲基化并不反映脑部表观遗传变化。
  • 表观特征： 聚类和基于 SVM 的分类未能将 MJD 样本与对照组或非 MJD 样本区分开来，证实了该队列中不存在可检测到的外周表观特征。

• 临床关联：

  • 病程： 在血液样本中，5,241 个 CpGs 的甲基化水平与病程显著相关（其中 1,705 个呈增加趋势，3,536 个呈减少趋势）。在这些 CpGs 中，PSMA5（ataxin-3 的直接相互作用因子）和 DNAJB2（间接相互作用因子）中的 CpGs 显示出显著关联。
  • 表观遗传年龄： 虽然患者和对照组均显示出正向的年龄加速，但两组之间没有显著差异。然而，在患者中，表观遗传年龄加速与病程呈负相关（即，较长的病程与相对的年龄减速相关）。
  • 其他变量： 未发现甲基化与 CAG 重复长度、发病年龄或 SARA 评分之间的显著关联。

意义与结论
本研究提供了首次跨脑部和血液的 MJD DNA 甲基化景观综合分析。作者得出结论，MJD 表现出微妙的 DNA 甲基化改变，这些改变主要发生在基因组区域（DMRs）层面，而非单个 CpG 位点层面。在脑部，这些改变具有明显的区域特异性：相对受累较轻的大脑皮层富集了与髓鞘形成相关的通路，而受严重影响的齿状核则表现出不同的调节模式。

在外周血液中，甲基化改变较为稀少，既不反映脑部的表观遗传变化，也无法定义一种疾病特异性的表观特征。值得注意的是，研究观察到临床前期携带者的甲基化改变比有症状患者更为显著，这表明分子变化在疾病演化的早期阶段可能最易被检测到。血液甲基化与病程的关联，以及表观遗传年龄加速与病程之间的反向关系，提示了与阶段相关的表观遗传动态，这值得在更大规模的纵向队列中进一步研究。研究结果强调，MJD 中的表观遗传失调主要不涉及直接针对致病基因 ATXN3 的甲基化调节，而是涉及更广泛的、组织特异性的调节网络。