Clonally selected hypoimmune limbal stem cells: an in vitro proof-of- concept towards an off-the-shelf therapy for limbal stem cell deficiency
本研究通过 CRISPR-Cas9 基因编辑和 CD47 过表达，展示了在体外生成克隆筛选、低免疫原性角膜缘干细胞的概念验证，这些细胞在成功规避同种异体免疫排斥的同时，仍能保持干细胞的特性与扩增能力，从而为开发一种可规模化、现货型的角膜缘干细胞缺乏症疗法铺平了道路。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
人类的眼睛依赖于一个被称为角膜的清晰透明窗口来聚焦光线并产生清晰的视觉。这个窗口并非一块静态的玻璃片，而是一种不断自我更新的活体组织，就像我们手臂或腿上的皮肤一样。这种更新是由一群被称为角膜缘干细胞的特殊细胞管理的，它们居住在角膜边缘的一条狭窄环带中。这些细胞充当一个“储备库”，通过分裂产生新的角膜细胞，并向内迁移以替换因日常使用而磨损的细胞。当这个储备库因受伤、感染或疾病而受损或被破坏时，就会发生被称为角膜缘干细胞缺乏症的病症。如果没有这些细胞，透明的角膜会被来自周围眼白部分的血管和瘢痕组织侵入，从而导致疼痛、失明以及永久性的透明度丧失。
治疗这种病症通常涉及从捐赠者或患者自身健康的眼睛中移植健康的干细胞。然而，这些手术面临着重大障碍。如果双眼都已受损，使用患者自身的眼睛往往是不可能的；而使用捐赠者的眼睛则存在风险，即患者的免疫系统会将新组织识别为异物并对其进行攻击，这一过程被称为排斥反应。为了防止这种情况，患者必须终身服用强效药物来抑制其免疫系统，这会带来严重的健康风险。此外，即使使用了这些药物，许多移植也会失败，因为所使用的特定细胞因人而异，这使得保证成功结果变得非常困难。科学家们长期以来一直寻求一种方法，来创造一种通用的、“现成的”细胞供应，使其可以用于任何患者而不触发排斥反应，但实现这一目标需要克服人体复杂的免疫防御机制。
纽卡斯尔大学的一个研究小组在实现这一目标方面取得了重大进展，他们工程化了一种新型的角膜缘干细胞，使其能够规避免疫系统。他们的方法涉及三种特定的基因改变，旨在使这些细胞对身体的防御机制“隐形”，同时保持其功能完备。首先，他们移除了两种特定表面蛋白（被称为 HLA I 类和 II 类）的遗传指令，这些蛋白就像“身份识别证”。没有了这些证件，免疫系统的 T 细胞就无法将这些细胞识别为需要摧毁的异物目标。其次，由于移除这些证件有时会引发来自自然杀伤细胞（natural killer cells）的另一种类型的免疫攻击，研究人员增加了第三种修改：他们增加了一种被称为 CD47 蛋白的产量。这种蛋白向免疫系统的“清理小组”——巨噬细胞——发送了一个“不要吃我”的信号，防止它们吞噬这些细胞。
为了使这种工程化成为可能，研究人员首先必须解决另一个问题：如何在实验室中长时间培养这些脆弱的干细胞而不让它们死亡或失去其特殊属性。干细胞在培养皿中极难存活；它们通常在短短几周内就会停止分裂或转化为普通的皮肤细胞。该团队发现，在培养基中添加一种被称为 ROCK 抑制剂的特定化学化合物，可以让这些细胞持续生长。利用这种方法，他们成功地使这些细胞进行了超过 200 代的扩增，这在以前从未实现过。在如此大规模的扩增过程中，这些细胞保留了它们的原始特性，看起来和表现得都与人类眼睛中的干细胞完全一致，并且仍然具备在需要时转化为角膜不同层结构的能力。
在拥有了稳定且健康的细胞供应后，研究人员应用了基因修改来创造这种“低免疫性”（hypoimmune）版本。他们使用一种精确的基因编辑工具切除了代表身份识别证的基因，并插入了一个用于增强“不要吃我”信号的基因。随后，他们将这些经过修改的细胞培育成克隆，以确保它们完全相同且安全。测试结果令人瞩目。当他们在培养皿中将这些工程化细胞与人类免疫细胞混合时，免疫系统在很大程度上忽略了它们。通常在遇到异体组织时会迅速增殖的 T 细胞保持了安静，并未发起攻击。同样，通常会吞噬并摧毁异体细胞的巨噬细胞也对工程化细胞不闻不问。即使在免疫细胞被刺激到高度攻击状态时也是如此，这表明这些细胞有效地对身体的主要防御机制实现了“隐形”。
有趣的是，研究人员发现，这些细胞躲避免疫系统的能力并不完全取决于“不要吃我”的信号。在一个意外的发现中，那些仅移除了身份识别证但未增加额外“不要吃我”信号的细胞，也被自然杀伤细胞在很大程度上忽略了。这表明角膜缘干细胞具有某些内在属性，可以保护它们免受这类特定攻击，这一发现为我们理解这些细胞如何与免疫系统相互作用增添了新的维度。然而，“不要吃我”的信号对于防止细胞被巨噬细胞吞噬仍然至关重要，这证实了“移除识别特征并添加保护信号”的双重策略是最有效的方法。
研究还观察了当这些细胞被允许成熟为角膜不同层时的情况。即使在细胞已经分化并改变外观后，它们仍能保持规避免疫检测的能力。这是一个关键发现，因为移植不仅需要干细胞，还需要形成一个完整、健康的组织结构。研究人员确认，这些工程化细胞仍然可以组织成一个适当的角膜层，并表达出健康眼睛的正确标志物。他们还注意到，虽然这些细胞在实验室环境中能非常有效地避开免疫系统，但在现实世界的治疗中，仍需考虑其他因素，例如血型兼容性以及细胞如果不受控制地生长可能引发的其他问题。
这项工作属于“概念验证”（proof-of-concept），这意味着它证明了该想法在受控的实验室环境下是行得通的。研究人员已经证明，可以创造出一种大规模、一致的、经过基因修改以确保对任何患者都安全的角膜缘干细胞供应。虽然这目前还不是一种可在医院使用的疗法，但它为未来一个这样的场景奠定了基础：即一名双眼失明的患者可以接受移植，而无需寻找匹配的捐赠者，也不必服用危险的免疫抑制药物。从实验室走向临床仍需进一步测试以确保长期安全性和有效性，但生成这种规模化的低免疫性细胞的能力，为解决这一目前仍让许多人面临失明困境的难题提供了真正的希望。
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