Clonally selected hypoimmune limbal stem cells: an in vitro proof-of- concept towards an off-the-shelf therapy for limbal stem cell deficiency

L'occhio umano si affida a una finestra chiara e trasparente chiamata cornea per focalizzare la luce e creare una visione nitida. Questa finestra non è un foglio di vetro statico, ma un tessuto vivente che si rinnova costantemente, proprio come la pelle sulle nostre braccia o sulle nostre gambe. Questo rinnovamento è gestito da una piccola popolazione di cellule specializzate chiamate cellule staminali limbiche, che risiedono in un sottile anello al bordo della cornea. Queste cellule agiscono come un serbatoio, dividendosi per creare nuove cellule corneali che migrano verso l'interno per sostituire quelle consumate dall'uso quotidiano. Quando questo serbatoio viene danneggiato o distrutto da lesioni, infezioni o malattie, si verifica la condizione nota come deficienza delle cellule staminali limbiche. Senza queste cellule, la cornea trasparente viene invasa da vasi sanguigni e tessuto cicatriziale provenienti dalla parte bianca circostante dell'occhio, portando a dolore, cecità e alla perdita permanente della trasparenza dell'occhio.

Trattare questa condizione comporta solitamente il trapianto di cellule staminali sane da un donatore o dall'occhio sano del paziente stesso. Tuttavia, queste procedure affrontano ostacoli significativi. L'uso dell'occhio del paziente è spesso impossibile se entrambi gli occhi sono danneggiati, e l'uso di un occhio da donatore comporta il rischio che il sistema immunitario del paziente riconosca il nuovo tessuto come estraneo e lo attacchi, un processo chiamato rigetto. Per prevenire questo, i pazienti devono assumere farmaci potenti per sopprimere il loro sistema immunitario per il resto della vita, il che comporta gravi rischi per la salute. Inoltre, anche con questi farmaci, molti trapianti falliscono perché le cellule specifiche utilizzate variano da persona a persona, rendendo difficile garantire un esito positivo. Gli scienziati cercano da tempo un modo per creare una fornitura universale, "pronta all'uso", di queste cellule che possano essere utilizzate per qualsiasi paziente senza scatenare il rigetto, ma ottenere ciò richiede di superare le sofisticate difese immunitarie del corpo.

Un team di ricercatori dell'Università di Newcastle ha compiuto un passo importante verso questo obiettivo, ingegnerizzando un nuovo tipo di cellula staminale limbica in grado di eludere il sistema immunitario. Il loro approccio prevede tre modifiche genetiche specifiche progettate per rendere le cellule invisibili alle difese del corpo pur mantenendole pienamente funzionali. Per prima cosa, hanno rimosso le istruzioni genetiche per due specifiche proteine di superficie, note come HLA di classe I e classe II, che agiscono come distintivi di identificazione. Senza questi distintivi, il sistema immunitario e i suoi linfociti T non possono riconoscere le cellule come bersagli estranei da distruggere. In secondo luogo, poiché la rimozione di questi distintivi può talvolta innescare un altro tipo di attacco immunitario da parte delle cellule natural killer, i ricercatori hanno aggiunto una terza modifica: hanno aumentato la produzione di una proteina chiamata CD47. Questa proteina invia un segnale di "non mangiare" alla squadra di pulizia del sistema immunitario, i macrofagi, impedendo loro di inghiottire le cellule.

Per rendere possibile questa ingegnerizzazione, i ricercatori hanno dovuto prima risolvere un problema diverso: come far crescere queste delicate cellule staminali in laboratorio per un lungo periodo senza che morissero o perdessero le loro proprietà speciali. Le cellule staminali sono notoriamente difficili da mantenere in vita in una piastra; spesso smettono di dividersi o si trasformano in comuni cellule della pelle dopo solo poche settimane. Il team ha scoperto che l'aggiunta di un composto chimico specifico, noto come inibitore di ROCK, al terreno di coltura permetteva alle cellule di crescere continuamente. Utilizzando questo metodo, sono stati in grado di espandere le cellule per più di 200 generazioni, un traguardo che non era mai stato raggiunto prima. Durante questa massiccia espansione, le cellule hanno mantenuto la loro identità originale, apparendo e comportandosi esattamente come le cellule staminali trovate nell'occhio umano, e sono rimaste capaci di trasformarsi nei diversi strati della cornea quando necessario.

Una volta ottenuta una fornitura stabile e sana di queste cellule, i ricercatori hanno applicato le modifiche genetiche per creare la versione ipoimmune. Hanno utilizzato uno strumento di editing genetico preciso per tagliare fuori i geni per i distintivi di identificazione e inserire un gene per potenziare il segnale "non mangiare". Hanno poi fatto crescere queste cellule modificate in cloni per garantire che fossero tutte identiche e sicure. I risultati dei loro test sono stati sorprendenti. Quando hanno mescolato queste cellule ingegnerizzate con cellule umane del sistema immunitario in una piastra, il sistema immunitario le ha ampiamente ignorate. I linfociti T, che di solito si moltiplicano rapidamente quando incontrano tessuto estraneo, sono rimasti tranquilli e non hanno attaccato. Allo stesso modo, i macrofagi, che di solito inglobano e distruggono le cellule estranee, hanno lasciato stare le cellule ingegnerizzate. Ciò è accaduto anche quando le cellule immunitarie erano state stimolate per essere altamente aggressive, suggerendo che le cellule fossero effettivamente invisibili ai principali meccanismi di difesa del corpo.

Interessante è stato scoprire che la capacità delle cellule di nascondersi dal sistema immunitario non dipendeva solo dal segnale "non mangiare". In una scoperta sorprendente, le cellule in cui erano stati solo rimossi i distintivi di identificazione, ma non il segnale extra "non mangiare", erano anch'esse ampiamente ignorate dalle cellule natural killer. Ciò suggerisce che le cellule staminali limbiche possiedano alcune proprietà intrinseche che le proteggono da questo specifico tipo di attacco, una scoperta che aggiunge un nuovo livello di comprensione a come queste cellule interagiscono con il sistema immunitario. Tuttavia, il segnale "non mangiare" era comunque cruciale per prevenire che le cellule venissero mangiate dai macrofagi, confermando che la doppia strategia di rimuovere l'identificazione e aggiungere un segnale protettivo è l'approccio più efficace.

Lo studio ha anche esaminato cosa accade quando queste cellule sono lasciate maturare nei diversi strati della cornea. Anche dopo che le cellule si erano differenziate e avevano cambiato aspetto, hanno mantenuto la loro capacità di evitare il rilevamento immunitario. Questa è una scoperta critica perché un trapianto richiede non solo cellule staminali, ma la capacità di formare una struttura tissutale completa e sana. I ricercatori hanno confermato che queste cellule ingegnerizzate potevano ancora organizzarsi in un corretto strato corneale ed esprimere i marcatori corretti di una cornea sana. Hanno anche notato che, sebbene le cellule fossero altamente efficaci nell'evitare il sistema immunitario in laboratorio, ci sono ancora altri fattori da considerare per un trattamento nel mondo reale, come la compatibilità del gruppo sanguigno e il potenziale delle cellule di causare altri problemi se dovessero crescere in modo incontrollato.

Questo lavoro rappresenta una prova di concetto, il che significa che dimostra che l'idea funziona in un ambiente di laboratorio controllato. I ricercatori hanno dimostrato che è possibile creare una fornitura grande e costante di cellule staminali limbiche che siano modificate geneticamente per essere sicure per qualsiasi paziente. Sebbene questo non sia ancora un trattamento disponibile in un ospedale, pone le basi per un futuro in cui un paziente con cecità in entrambi gli occhi possa ricevere un trapianto senza dover trovare un donatore compatibile o assumere pericolosi farmaci immunosoppressori. Il percorso dal laboratorio alla clinica richiederà ulteriori test per garantire sicurezza ed efficacia a lungo termine, ma la capacità di generare queste cellule ipoimmuni su larga scala offre una vera speranza per una soluzione universale a una condizione che attualmente lascia molti senza cura.