Structural Plasticity and Ligand Promiscuity of CYP3A4 Revealed by Cryo-EM

داخل جسم الإنسان، تعمل شبكة واسعة من المصانع الكيميائية بلا كلل لمعالجة الأدوية التي نتناولها. ومن بين هذه الشبكة، يعمل إنزيم واحد يسمى CYP3A4 كحارس بوابة رئيسي، وهو مسؤول عن تكسير ما يقرب من نصف جميع الأدوية الصيدلانية الموجودة حاليًا في السوق. هذا الإنزيم هو سيد التكيف؛ فغرفته الداخلية كبيرة ومرنة، مما يسمح له بالإمساك بمجموعة مذهلة من الجزيئات المختلفة كيميائيًا وتحويلها. ومع ذلك، فإن هذه المرونة ذاتها تجعل منه كابوسًا للعلماء الذين يحاولون التنبؤ بكيفية تصرف دواء جديد. ولأن شكل الإنزيم يتغير لاستيعاب ضيوف مختلفين، فمن الصعب معرفة أين سيستقر الدواء بالضبط أو كيف سيتم تعديله. وإذا لم يتمكن العلماء من التنبؤ بهذه التفاعلات، فإنهم يخاطرون بآثار جانبية خطيرة أو فشل غير متوقع في التجارب السريرية، مما يجعل القدرة على رؤية شكل الإنزيم أثناء العمل هدفًا حاسمًا للطب الحديث.

لعقود من الزمن، حاول الباحثون التقاط شكل CYP3A4 باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية (X-ray crystallography)، وهي تقنية تتطلب تجميد الإنزيم في بلورة صلبة. ولجعل ذلك ممكنًا، اضطروا إلى قطع ذيل صغير لزج من الإنزيم، وهو الذيل الذي يثبته عادةً في غشاء الخلية. وبينما سمح لهم ذلك بالتقاط الصور، إلا أن الهياكل الناتجة غالبًا ما أظهرت نسخة واحدة صلبة من الإنزيم، مما أدى إلى فقدان الحركات الديناميكية التي تحدث عند تفاعله مع الأدوية الحقيقية. علاوة على على ذلك، كانت البلورات تميل إلى التكون فقط مع أنواع محددة من الأدوية، مما ترك فجوات كبيرة في فهمنا لكيفية تعامل الإنزيم مع العالم الكيميائي المتنوع الذي يواجهه يوميًا. والآن، توجهت دراسة جديدة أجرتها آنا كارين أورتا وزملاؤها في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو وسكريبس للأبحاث إلى تقنية مختلفة تسمى المجهر الإلكتروني برد الفري (cryo-electron microscopy)، أو cryo-EM. وتسمح هذه الطريقة للعلماء بتجميد جزيئات الإنزيم الفردية بسرعة في حالتها السائلة الطبيعية والتقاط آلاف الصور لإعادة بناء أشكالها ثلاثية الأبعاد دون الحاجة إلى إجبارها على التوافق مع شبكة بلورية.

بدأ الباحثون بأخذ نفس النسخة المقطوعة من الإنزيم المستخدمة في دراسات البلورات السابقة ومراقبة كيفية سلوكه في المحلول. وبدلاً من الطفو كأجزاء منفردة، اكتشفوا أن هذه الجزيئات تتكتل طبيعيًا لتشكل هيكلًا مستقرًا ثلاثي الأجزاء، يشبه البرسيم ثلاثي الأوراق. كان هذا التجمع الثلاثي كبيرًا بما يكفي لتصويره بوضộ وضوح بواسطة تقنية cryo-EM، مما سمح للفريق ببناء خريطة عالية الدقة للإنزيم في حالته غير المرتبطة. وكشفت الصورة الناتجة أنه بينما ظل قلب الإنزيم مستقرًا، كانت الحلقات الخارجية والمناطق المرنة أكثر ديناميكية مما كان يُعتقد سابقًا. والأهم من ذلك، وجد الفريق أن طريقة تجميع هذه الجزيات معًا لم تسد موقع النشاط الخاص بالإنزيم، مما يشير إلى أن هذا الترتيب الثلاثي يمكن أن يكون نموذجًا صالحًا لدراسة كيفية عمل الإنزيم، حتى بدون مرساة الغشاء الطبيعية.

ومع ترسيخ هذه الطريقة الجديدة، انتقل الفريق لمعرفة كيفية تفاعل الإنزيم مع الأدوية الفعلية. اختبروا أولاً عقار ريتونافير (ritonavir)، وهو مثبط قوي يستخدم لتعزيز فعالية أدوية أخرى. وأكدت صور cryo-EM أن ريتونافير يستقر في مركز الإنزيم بطريقة محددة للغاية، ممسكًا بذرة حديد مركزية مثل المفتاح في القفل. وطابقت هذه النتيجة ما كان معروفًا من دراسات الأشعة السينية، مما أثبت صحة النهج الجديد. ومع ذلك، عندما نظروا إلى كيتوكونازول (ketoconazole)، وهو عقار مضاد للفطريات شائع آخر، قدمت الصور قصة مختلفة تمامًا. فبينما أشارت بلورات الأشعة السينية إلى إمكانية تكدس جزيئين من الكيتوكونازول فوق بعضهما البعض داخل الإنزيم في نفس الوقت، أظهرت بيانات cryo-EM شيئًا مختلفًا تمامًا. فقد كشفت خرائط الكثافة أن الإنزيم يستوعب في الواقع شكلين مختلفين للدواء، لكنه لا يستوعب كليهما في وقت واحد. يبدو أن الإنزيم يغير شكله ليتناسب مع أحد الإصدارين أو الآخر، وهي مرونة افتقدتها هياكل البلورات الصلبة.

ذهبت الدراسة أبعد من ذلك بفحص عقار أزامولين (azamulin)، وهو دواء يرتبط بالإنزيم دون لمس ذرة الحديد المركزية، وفاردينـافيل (vardenafil)، وهو دواء يستخدم لعلاج ضعف الانتصاب لم تكن هناك بيانات هيكلية له قبل هذا العمل. وفي كلتا الحالتين، كشفت صور cryo-EM أن الإنزيم يمكنه اتخاذ أشكال متعددة للإمساك بالدواء. وبالنسبة لفاردينـافيل، لاحظ الباحثون موضعين متميزين يمكن أن يتخذهما الدواء داخل الموقع النشط، ولم يتطابق أي منهما مع التوقعات العليا التي قدمتها برامج النمذجة الحاسوبية الحالية. وتعد هذه النتيجة مهمة لأنها تسلط الضوء على نقطة عمياء في تصميم الأدوية الحديثة: فالخوارزميات التي يستخدمها العلماء للتنبؤ بكيفية ملاءمة الأدوية للإنزيمات تفشل في التقاط الطبيعة المتغيرة والحقيقية لـ CYP3A4. فغالبًا ما تفترض النماذج الحاسوبية شكلاً ثابتًا، لكن الإنزيم هو بوضوح آلة سائلة تعيد تشكيل نفسها لتناسب الضيوف المختلفين.

ولفهم مدى انتشار هذه المشكلة، اختبر الباحثون برنامج النمذجة الحاسوبية الخاص بهم مقابل مكتبة ضخمة تضم أكثر من مائة هيكل معروف للإنزيم. نجح البرنامج في التنبؤ بالموضع الصحيح للدواء في حوالي ستين بالمائة من الحالات فقط، وانخفض أداؤه بشكل أكبر للهياكل الجديدة التي لم يسبق له رؤيتها. وكانت حالات الفشل أكثر دراماتيكية عندما ارتبط الدواء بجيب ثانوي مخفي على الإنزيم بدلاً من الموقع النشط الرئيسي، أو عندما تطلب الدواء من الإنزيم تغيير شكله بطريقة لم يتوقعها البرنامج. وتخلص الدراسة إلى أن قدرة الإنزيم على التعرف على مجموعة واسعة من المواد الكيميائية، بالإضافة إلى ميله لتغيير شكله، تجعل منه أحد أصعب الأهداف للتنبؤ.

إن الآثار المترتبة على هذه النتائج عميقة بالنسبة لمستقبل تطوير الأدوية. فمن خلال تقديم رؤية واضحة وعالية الدقة لكيفية تحرك CYP3A4 وارتباطه بالجزيئات المختلفة، يقدم هذا العمل مجموعة جديدة من الحقائق الأساسية ليتعلم منها العلماء. ويقترح الباحثون أن الاستخدام الروتيني لتقنية cryo-EM لرسم خرائط هذه التفاعلات سيوفر البيانات اللازمة لتدريب نماذج حاسوبية أفضل. وحتى الآن، اعتمد المجال على مجموعة محدودة من هياكل البلورات الثابتة التي غالبًا ما تغفل أهم سلوكيات الإنزيم. ومع القدرة على رؤية الإنزيم في أشكاله العديدة، يمكن للعلماء البدء في بناء أدوات تنبؤية مفيدة حقًا، مما يساعد في توقع التفاعلات الدوائية والمشكلات الأيضية قبل أن يصل أي دواء جديد إلى المريض. لا تدعي الدراسة أنها حلت مشكلة التنبؤ باستقلاب الأدوية، لكنها أضاءت الطريق للمضي قدمًا، موضحة أنه لفهم هذا الحارس المعقد، يجب أن نتوقف عن النظر إليه كتمثال جامد ونبدأ في رؤيته كآلة مرنة ومتغيرة كما هو في الواقع.