Structural Plasticity and Ligand Promiscuity of CYP3A4 Revealed by Cryo-EM

मानव शरीर के भीतर, रासायनिक कारखानों का एक विशाल नेटवर्क हमारी ली गई दवाओं को संसाधित करने के लिए अथक कार्य करता है। इनमें से, CYP3A4 नामक एक एकल एंजाइम एक प्राथमिक द्वारपाल (gatekeeper) के रूप में कार्य करता है, जो वर्तमान में बाजार में मौजूद लगभग सभी फार्मास्युटिकल दवाओं में से आधे को तोड़ने के लिए जिम्मेदार है। यह एंजाइम अनुकूलन का माहिर है; इसका आंतरिक कक्ष बड़ा और लचीला है, जो इसे रासायनिक रूप से भिन्न अणुओं की एक चक्करदार श्रृंखला को पकड़ने और बदलने की अनुमति देता है। हालांकि, यही लचीलापन इसे वैज्ञानिकों के लिए एक दुःस्वप्न बना देता है जो यह अनुमान लगाने की कोशिश कर रहे हैं कि एक नई दवा कैसे व्यवहार करेगी। क्योंकि एंजाइम का आकार विभिन्न मेहमानों को समायोजित करने के लिए बदल जाता है, इसलिए यह जानना कठिन है कि कोई दवा ठीक कहाँ जाकर टिकेगी या उसे कैसे बदला जाएगा। यदि वैज्ञानिक इन अंतःक्रियाओं का अनुमान नहीं लगा सकते हैं, तो वे खतरनाक दुष्प्रभावों या नैदानिक परीक्षणों (clinical trials) में अप्रत्याशित विफलताओं का जोखिम उठाते हैं, जिससे एंजाइम के आकार को उसके सक्रिय रूप में देखने की क्षमता आधुनिक चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन जाती है।

द दशकों से, शोधकर्ताओं ने एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके CYP3A4 के आकार को पकड़ने का प्रयास किया है, जो एक ऐसी तकनीक है जिसके लिए एंजाइम को एक कठोर क्रिस्टल में जमाना आवश्यक होता है। इसे संभव बनाने के लिए, उन्हें एंजाइम से एक छोटा, चिपचिपा हिस्सा (tail) काटना पड़ा जो सामान्यतः इसे कोशिका झिल्ली (cell membrane) से जोड़कर रखता है। हालांकि इसने उन्हें तस्वीरें लेने की अनुमति दी, लेकिन प्राप्त संरचनाएं अक्सर एंजाइम के केवल एक एकल, सख्त संस्करण को दिखाती थीं, जिससे वे गतिशील गतिविधियाँ छूट जाती थीं जो वास्तविक दवाओं के साथ बातचीत करते समय होती हैं। इसके अलावा, क्रिस्टल केवल विशिष्ट प्रकार की दवाओं के साथ ही बनते थे, जिससे उस विविध रासायनिक दुनिया के बारे में हमारी समझ में बड़े अंतराल रह गए जिसका सामना यह एंजाइम प्रतिदिन करता है। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन फ्रांसिस्को और स्क्रीप्स रिसर्च के अन्ना कारेन ओर्टा और उनके सहयोगियों द्वारा किए गए एक नए अध्ययन ने अब 'क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी' या 'क्रायो-ईएम' (cryo-EM) नामक एक अलग तकनीक की ओर रुख किया है। यह विधि वैज्ञानिकों को व्यक्तिगत एंजाइम अणुओं को उनकी प्राकृतिक, तरल अवस्था में फ्लैश-फ्रीज करने और उनकी 3D आकृतियों को पुनर्गठित करने के लिए हजारों तस्वीरें लेने की अनुमति देती है, जिसमें उन्हें किसी क्रिस्टल जाली (lattice) में मजबूर करने की आवश्यकता नहीं होती।

शोधकर्ताओं ने पहले उसी कटे हुए संस्करण वाले एंजाइम को लिया जिसका उपयोग पिछले क्रिस्टल अध्ययनों में किया गया था और समाधान (solution) में इसके व्यवहार का अवलोकन किया। एकल इकाइयों के रूप में तैरने के बजाय, उन्होंने पाया कि ये अणु स्वाभाविक रूप से आपस में जुड़कर एक स्थिर, तीन-भाग वाली संरचना बनाते हैं, जो एक तीन पत्तियों वाले क्लोवर (clover) जैसा दिखता है। यह ट्राइमेरिक असेंबली (trimeric assembly) क्रायो-ईएम द्वारा स्पष्ट रूप से इमेज करने के लिए पर्याप्त बड़ी थी, जिससे टीम को अनबाउंड अवस्था में एंजाइम का उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र बनाने में मदद मिली। परिणामी छवि ने खुलासा किया कि जबकि एंजाइम का मुख्य भाग (core) स्थिर रहता है, बाहरी लूप और लचीले क्षेत्र पहले की तुलना में कहीं अधिक गतिशील थे। महत्वपूर्ण रूप से, टीम ने पाया कि इन अणुओं के एक साथ समूह बनाने के तरीके ने एंजाइम के सक्रिय स्थल (active site) को बाधित नहीं किया, जिससे यह संकेत मिलता है कि यह तीन-भाग वाली व्यवस्था इस बात का एक वैध मॉडल हो सकती है कि एंजाइम कैसे काम करता है, भले ही इसमें इसका प्राकृतिक झिल्ली एंकर (membrane anchor) न हो।

इस नई पद्धति को स्थापित करने के बाद, टीम आगे बढ़ी यह देखने के लिए कि एंजाइम वास्तव में दवाओं के साथ कैसे अंतःक्रिया करता है। उन्होंने सबसे पहले रिटाविर (ritonavir) का परीक्षण किया, जो अन्य दवाओं के प्रभाव को बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक शक्तिशाली अवरोधक (inhibitor) है। क्रायो-ईएम छवियों ने पुष्टि की कि रिटाविर एंजाइम के केंद्र में बहुत विशिष्ट तरीके से लॉक हो जाता है, एक ताले में चाबी की तरह केंद्रीय आयरन परमाणु को थामे रखता है। यह परिणाम एक्स-रे अध्ययनों से ज्ञात जानकारी से मेल खाता है, जो इस नई पद्धति की वैधता सिद्ध करता है। हालांकि, जब उन्होंने कीटोकोनाज़ोल (ketoconazole), जो एक अन्य सामान्य एंटीफंगल दवा है, को देखा, तो तस्वीरों ने एक अलग कहानी सुनाई। जबकि एक्स-रे क्रिस्टल ने सुझाव दिया था कि कीटोकोनाज़ोल के दो अणु एक ही समय में एंजाइम के अंदर एक के ऊपर एक स्टैक हो सकते हैं, क्रायो-ईएम डेटा ने कुछ और ही दिखाया। डेंसिटी मैप्स ने खुलासा किया कि एंजाइम वास्तव में दवा के दो अलग-अलग रूपों को समायोजित करता है, लेकिन दोनों को एक साथ कभी नहीं। ऐसा प्रतीत होता है कि एंजाइम एक संस्करण या दूसरे को फिट करने के लिए अपना आकार बदल लेता है, एक ऐसा लचीलापन जिसे कठोर क्रिस्टल संरचनाओं ने मिस कर दिया था।

अध्ययन ने अज़ामुलिन (azamulin) की जांच करके भी आगे बढ़ाया, जो केंद्रीय आयरन परमाणु को छुए बिना बंधता है, और वर्डेनाफिल (vardenafil), जो इरेक्टाइल डिसफंक्शन के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली एक दवा है जिसके लिए इस कार्य से पहले कोई संरचनात्मक डेटा मौजूद नहीं था। दोनों मामलों में, क्रायो-ईएम छवियों ने खुलासा किया कि एंजाइम दवा को थामने के लिए कई आकार अपना सकता है। वर्डेनाफिल के लिए, शोधकर्ताओं ने दवा की दो विशिष्ट स्थितियों का अवलोकन किया जो सक्रिय स्थल के भीतर ले सकती है, जिनमें से कोई भी वर्तमान कंप्यूटर मॉडलिंग सॉफ्टवेयर द्वारा किए गए शीर्ष अनुमानों से मेल नहीं खाता था। यह खोज महत्वपूर्ण है क्योंकि यह आधुनिक ड्रग डिज़ाइन के एक अंधे धब्बे (blind spot) को उजागर करती है: वे एल्गोरिदम जिनका उपयोग वैज्ञानिक यह अनुमान लगाने के लिए करते हैं कि दवाएं एंजाइमों में कैसे फिट होती हैं, वे CYP3A4 की वास्तविक, परिवर्तनशील प्रकृति को पकड़ने में विफल हो रहे हैं। कंप्यूटर मॉडल अक्सर एक स्थिर आकार मान लेते हैं, लेकिन एंजाइम स्पष्ट रूप से एक तरल मशीन है जो विभिन्न मेहमानों के अनुकूल होने के लिए खुद को नया आकार देता है।

यह समझने के लिए कि यह समस्या कितनी व्यापक है, शोधकर्ताओं ने अपने कंप्यूटर मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का परीक्षण एंजाइम की सौ से अधिक ज्ञात संरचनाओं के विशाल पुस्तकालय के विरुद्ध किया। सॉफ्टवेयर केवल लगभग साठ प्रतिशत मामलों में दवा की सही स्थिति का अनुमान लगाने में सफल रहा, और नए संरचनाओं के लिए, जिन्हें उसने पहले नहीं देखा था, इसका प्रदर्शन और भी गिर गया। विफलताएं तब सबसे नाटकीय थीं जब दवा मुख्य सक्रिय स्थल के बजाय एंजाइम के एक माध्यमिक, छिपे हुए पॉकेट (pocket) से जुड़ी थी, या जब दवा को ऐसे तरीके से आकार बदलने की आवश्यकता थी जिसकी सॉफ्टवेयर ने कल्पना नहीं की थी। अध्ययन निष्कर्ष निकालता है कि रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला को पहचानने की एंजाइम की क्षमता, और आकार बदलने की इसकी प्रवृत्ति के साथ मिलकर, इसे भविष्यवाणी के लिए सबसे कठिन लक्ष्यों में से एक बनाती है।

इन निष्कर्षों के निहितार्थ दवा विकास के भविष्य के लिए अत्यंत गहरे हैं। इन अंतःक्रियाओं को मैप करने के लिए क्रायो-ईएम का उपयोग करके वैज्ञानिकों को सीखने के लिए सत्य के एक नए सेट के दृश्य प्रदान करके, यह कार्य एक स्पष्ट, उच्च-रिज़ॉल्यूशन दृश्य प्रदान करता है कि CYP3A4 वास्तव में कैसे चलता है और विभिन्न अणुओं से कैसे जुड़ता है। शोधकर्ता सुझाव देते हैं कि इन अंतःक्रियाओं को मैप करने के लिए क्रायो-ईएम का नियमित उपयोग उन बेहतर कंप्यूटर मॉडलों को प्रशिक्षित करने के लिए आवश्यक डेटा प्रदान करेगा। अब तक, यह क्षेत्र क्रिस्टल संरचनाओं के एक सीमित सेट पर निर्भर रहा है जो अक्सर एंजाइम के सबसे महत्वपूर्ण व्यवहारों को मिस कर देते हैं। इसके कई रूपों में एंजाइम को देखने की क्षमता के साथ, वैज्ञानिक ऐसे भविष्य कहने वाले उपकरण बनाना शुरू कर सकते हैं जो वास्तव में उपयोगी हों, जिससे किसी भी नई दवा के मरीज तक पहुँचने से पहले ही दवा के अंतर्संबंधों और चयापचय संबंधी समस्याओं का पूर्वानुमान लगाया जा सके। अध्ययन यह दावा नहीं करता है कि उसने दवा चयापचय (drug metabolism) की भविष्यवाणी करने की समस्या को हल कर लिया है, लेकिन इसने आगे के मार्ग को आलोकित किया है, यह दिखाते हुए कि इस जटिल द्वारपाल को समझने के लिए, हमें इसे एक कठोर मूर्ति के रूप में देखना बंद करना होगा और इसे एक लचीली, परिवर्तनशील मशीन के रूप में देखना शुरू करना होगा जैसा कि यह वास्तव में है।