Structural Plasticity and Ligand Promiscuity of CYP3A4 Revealed by Cryo-EM

All'interno del corpo umano, una vasta rete di fabbriche chimiche lavora instancabilmente per elaborare i medicinali che assumiamo. Tra queste, un singolo enzima chiamato CYP3A4 agisce come un primario guardiano, responsabile della scomposizione di circa la metà di tutti i farmaci attualmente in commercio. Questo enzima è un maestro di adattamento; la sua camera interna è grande e flessibile, permettendogli di afferrare e trasformare una vertiginosa gamma di molecole chimicamente differenti. Tuttavia, questa stessa flessibilità lo rende un incubo per gli scienziati che cercano di prevedere come un nuovo farmaco si comporterà. Poiché la forma dell'enzima cambia per accogliere ospiti diversi, è difficile sapere esattamente dove un farmaco si posizionerà o come verrà alterato. Se gli scienziati non riescono a prevedere queste interazioni, rischiano effetti collaterali pericolosi o fallimenti inaspettati nelle sperimentazioni cliniche, rendendo la capacità di vedere la forma dell'enzima in azione un obiettivo critico per la medicina moderna.

Per decenni, i ricercatori hanno cercato di catturare la forma di CYP3A4 utilizzando la cristallografia a raggi X, una tecnica che richiede il congelamento dell'enzima in un cristallo rigido. Per rendere possibile questo, hanno dovuto tagliare una piccola coda appiccicosa dall'enzima che normalmente lo ancora alla membrana cellulare. Sebbene ciò abbia permesso loro di scattare foto, le strutture risultanti mostravano spesso solo una versione singola e rigida dell'enzima, perdendo i movimenti dinamici che avvengono quando interagisce con i farmaci reali. Inoltre, i cristalli tendevano a formarsi solo con tipi specifici di farmaci, lasciando grandi lacune nella nostra comprensione di come l'enzima gestisca il diversificato mondo chimico che incontra quotidianamente. Un nuovo studio di Anna Karen Orta e dei suoi colleghi della University of California San Francisco e della Scripps Research si è ora rivolto a una tecnologia diversa chiamata criomicroscopia elettronica, o cryo-EM. Questo metodo permette agli scienziati di congelare istantaneamente singole molecole di enzima nel loro stato liquido naturale e scattare migliaia di foto per ricostruire le loro forme 3D senza la necessità di forzarle in un reticolo cristallino.

I ricercatori hanno iniziato prendendo la stessa versione dell'enzima con la coda tagliata utilizzata negli studi precedenti con i cristalli e osservando come si comportava in soluzione. Invece di fluttuare come unità singole, hanno scoperto che queste molecole si raggruppavano naturalmente per formare una struttura stabile a tre parti, simile a un trifoglio. Questo assemblaggio trimerico era abbastanza grande da essere visualizzato chiaramente dalla cryo-EM, permettendo al team di costruire una mappa ad alta risoluzione dell'enzima nello stato non legato. L'immagine risultante ha rivelato che, mentre il nucleo dell'enzima rimaneva stabile, i loop esterni e le regioni flessibili erano molto più dinamici di quanto precedentemente ipotizzato. Fondamentalmente, il team ha scoperto che il modo in cui queste molecole si raggruppavano non bloccava il sito attivo dell'enzima, suggerendo che questa disposizione a tre parti potesse essere un modello valido per studiare come l'enzima funziona, anche senza il suo naturale ancoraggio alla membrana.

Con questo nuovo metodo stabilito, il team è passato a vedere come l'enzima interagisce con i farmaci effettivi. Hanno testato prima il ritonavir, un potente inibitore utilizzato per potenziare altri medicinali. Le immagini cryo-EM hanno confermato che il ritonavir si incastra nel centro dell'enzima in un modo molto specifico, aggrappandosi a un atomo di ferro centrale come una chiave in una serratura. Questo risultato corrispondeva a quanto noto dagli studi a raggi X, convalidando il nuovo approccio. Tuttavia, quando hanno esaminato il ketoconazolo, un altro comune antifungino, le immagini hanno raccontato una storia diversa. Mentre i cristalli a raggi X avevano suggerito che due molecole di ketoconazolo potessero impilarsi l'una sull'altra all'interno dell'enzima contemporaneamente, i dati cryo-EM hanno mostrato qualcosa di completamente diverso. Le mappe di densità hanno rivelato che l'enzima in realtà ospita due diverse forme del farmaco, ma mai entrambe contemporaneamente. L'enzima sembra cambiare forma per adattarsi a una versione o all'altra, una flessibilità che le strutture rigide dei cristalli avevano mancato.

Lo studio è andato oltre, esaminando l'azamulina, un farmaco che si lega senza toccare l'atomo di ferro centrale, e il vardenafil, un farmaco utilizzato per trattare la disfunzione erettile per il quale non esistevano dati strutturali precedenti a questo lavoro. In entrambi i casi, le immagini cryo-EM hanno rivelato che l'enzima può adottare molteplici forme per trattenere il farmaco. Per il vardenafil, i ricercatori hanno osservato due posizioni distinte che il farmaco poteva assumere all'interno del sito attivo, nessuna delle quali corrispondeva alle migliori previsioni fatte dai software di modellazione computerizzata attuali. Questa scoperta è significativa perché evidenzia un punto cieco nella moderna progettazione di farmaci: gli algoritmi che gli scienziati usano per prevedere come i farmaci si inseriscono negli enzimi stanno fallendo nel catturare la vera natura mutevole di CYP3A4. I modelli informatici spesso assumono una forma statica, ma l'enzima è chiaramente una macchina fluida che si rimodella per accogliere diversi ospiti.

Per capire quanto fosse diffuso questo problema, i ricercatori hanno testato il loro software di modellazione computerizzata contro una vasta libreria di oltre cento strutture note dell'enzima. Il software è riuscito a prevedere la posizione corretta di un farmaco in circa il sessanta per cento dei casi, e le sue prestazioni sono scese ulteriormente per le strutture più recenti che non aveva ancora visto. I fallimenti sono stati più drammatici quando il farmaco si legava a una tasca secondaria e nascosta dell'enzima piuttosto che al sito attivo principale, o quando il farmaco richiedeva che l'enzima cambiasse forma in un modo che il software non aveva anticipato. Lo studio conclude che la capacità dell'enzima di riconoscere una vasta gamma di sostanze chimiche, unita alla sua tendenza a cambiare forma, lo rende uno degli obiettivi più difficili da prevedere.

Le implicazioni di queste scoperte sono profonde per il futuro dello sviluppo di farmaci. Fornendo una visione chiara e ad alta risoluzione di come il CYP3A4 si muove e si lega a diverse molecole, questo lavoro offre un nuovo insieme di verità fondamentali da cui gli scienziati possano imparare. I ricercatori suggeriscono che l'uso routinario della cryo-EM per mappare queste interazioni fornirà i dati necessari per addestrare migliori modelli informatici. Finora, il campo si è basato su un set limitato di strutture cristalline statiche che spesso perdono i comportamenti più importanti dell'enzima. Con la capacità di vedere l'enzima nelle sue molteplici forme, gli scienziati possono iniziare a costruire strumenti predittivi che siano veramente utili, aiutando ad anticipare le interazioni tra farmaci e i problemi metabolici prima che un nuovo medicinale raggiunga un paziente. Lo studio non sostiene di aver risolto il problema della previsione del metabolismo dei farmaci, ma ha illuminato la strada da seguire, mostrando che per comprendere questo complesso guardiano, dobbiamo smettere di guardarlo come una statua rigida e iniziare a vederlo come la macchina flessibile e mutevole che è realmente.