Structural Plasticity and Ligand Promiscuity of CYP3A4 Revealed by Cryo-EM

Binnen het menselijk lichaam werkt een enorm netwerk van chemische fabrieken onvermoeibaar om de medicijnen die we innemen te verwerken. Onder deze werken fungeert een enkel enzym genaamd CYP3A4 als een primaire poortwachter, verantwoordelijk voor de afbraak van ongeveer de helft van alle farmaceutische geneesmiddelen die momenteel op de markt zijn. Dit enzym is een meester in adaptatie; zijn interne kamer is groot en flexibel, waardoor het een duizelingwekkende variëteit aan chemisch verschillende moleculen kan grijpen en transformeren. Deze flexibiliteit maakt het echter tot een nachtmerrie voor wetenschappers die proberen te voorspellen hoe een nieuw medicijn zich zal gedragen. Omdat de vorm van het enzym verschuift om verschillende gasten te accommoderen, is het moeilijk te weten waar een medicijn precies zal landen of hoe het zal worden aangepast. Als wetenschappers deze interacties niet kunnen voorspellen, riskeren ze gevaarlijke bijwerkingen of onverwachte mislukkingen in klinische studies, waardoor het vermogen om de vorm van het enzym in actie te zien een cruciaal doel is voor de moderne geneeskunde.

Decennialang hebben onderzoekers geprobeerd de vorm van CYP3A4 vast te leggen met behulp van röntgencristallografie, een techniek die vereist dat het enzym wordt bevroren in een rigide kristal. Om dit mogelijk te maken, moesten ze een klein, plakkerig staartje van het enzym afsnijden dat normaal gesproken aan het celmembraan verankerd is. Hoewel dit hen in staat stelde om foto's te maken, toonden de resulterende structuren vaak slechts één enkele, stijve versie van het enzym, waarbij de dynamische bewegingen die plaatsvinden wanneer het interageert met echte medicijnen werden gemist. Bovendien hadden de kristallen de neiging om alleen met specifieke soorten medicijnen te vormen, waardoor er grote hiaten ontstonden in ons begrip van hoe het enzym de diverse chemische wereld tegenkomt die het dagelijks ervaart. Een nieuwe studie door Anna Karen Orta en haar collega's aan de University of California San Francisco en Scripps Research heeft nu gekozen voor een andere technologie genaamd cryo-elektronenmicroscopie, of cryo-EM. Deze methode stelt wetenschappers in staat om individuele enzymmoleculen in hun natuurlijke, vloeibare staat razendsnel te bevriezen en duizenden foto's te maken om hun 3D-vormen te reconstrueren zonder ze in een kristalrooster te hoeven dwingen.

De onderzoekers begonnen door dezelfde ingekorte versie van het enzym te gebruiken die in eerdere kristalstudies werd gebruikt en te observeren hoe het zich in oplossing gedroeg. In plaats van rond te drijven als losse eenheden, ontdekten ze dat deze moleculen van nature samenklonterden om een stabiele, drieledige structuur te vormen, die lijkt op een klavertje drie. Deze trimere assemblage was groot genoeg om duidelijk te worden afgebeeld door cryo-EM, waardoor het team een hoogwaardige kaart van het enzym in zijn ongebonden staat kon opbouwen. De resulterende afbeelding onthulde dat terwijl de kern van het enzym stabiel bleef, de buitenste lussen en flexibele regio's veel dynamischer waren dan voorheen gedacht. Cruciaal was dat het team ontdekte dat de manier waarop deze moleculen samenklonteren de actieve site van het enzym niet blokkeerde, wat suggereert dat deze drieledige rangschikking een geldige methode kan zijn om te bestuderen hoe het enzym werkt, zelfs zonder zijn natuurlijke membraananker.

Met deze nieuwe methode gevestigd, ging het team over tot het bekijken van hoe het enzym interageert met werkelijke medicijnen. Ze testten eerst ritonavir, een krachtige remmer die wordt gebruikt om andere medicijnen te versterken. De cryo-EM-beelden bevestigden dat ritonavir op een zeer specifieke manier in het centrum van het enzym vergrendelt, waarbij het een centraal ijzeratoom vasthoudt als een sleutel in een slot. Dit resultaat kwam overeen met wat bekend was uit röntgenstudies, wat de nieuwe aanpak valideerde. Echter, toen ze naar ketoconazol keken, een ander veelvoorkomend antischimmelmedicijn, vertelden de beelden een ander verhaal. Waar röntgenkristallen hadden gesuggereerd dat twee moleculen ketoconazol tegelijkertijd bovenop elkaar zouden kunnen stapelen in het enzym, toonden de cryo-EM-gegevens iets heel anders. De dichtheidskaarten onthulden dat het enzym feitelijk twee verschillende vormen van het medicijn huisvest, maar nooit beide tegelijkertijd. Het enzym lijkt van vorm te veranderen om de ene of de andere versie te passen, een flexibiliteit die de rigide kristalstructuren hadden gemist.

De studie ging verder door azamulin te onderzoeken, een medicijn dat bindt zonder het centrale ijzeratoom aan te raken, en vardenafil, een medicijn gebruikt voor de behandeling van erectiestoornissen waarvoor vóór dit werk geen structurele gegevens bestonden. In beide gevallen toonden de cryo-EM-beelden aan dat het enzym meerdere vormen kan aannemen om het medicijn vast te houden. Voor vardenafil observeerden de onderzoekers twee verschillende posities die het medicijn binnen de actieve site kon innemen, waarvan er geen overeenkwamen met de topvoorspellingen gemaakt door de huidige computerondersteunde modelleringssoftware. Deze bevinding is significant omdat het een blinde vlek in de moderne medicijnontwikkeling belicht: de algoritmen die wetenschappers gebruiken om te voorspellen hoe medicijnen in enzymen passen, slagen er niet in de ware, verschuivende aard van CYP3A4 te vangen. De computermodellen gaan vaak uit van een statische vorm, maar het enzym is duidelijk een vloeiende machine die zichzelf hervormt om verschillende gasten te passen.

Om te begrijpen hoe wijdverspreid dit probleem is, testten de onderzoekers hun computerondersteunde modelleringssoftware tegen een enorme bibliotheek van meer dan honderd bekende structuren van het enzym. De software slaagde erin de juiste positie van een medicijn in slechts ongeveer zestig procent van de gevallen te voorspellen, en de prestaties daalden nog verder voor nieuwere structuren die de software nog niet eerder had gezien. De fouten waren het meest dramatisch wanneer het medicijn aan een secundaire, verborgen zak op het enzym bond in plaats van aan de hoofdzak, of wanneer het medicijn vereiste dat het enzym van vorm veranderde op een manier die de software niet had voorzien. De studie concludeert dat het vermogen van het enzym om een enorme reeks chemicaliën te herkennen, gecombineerd met de neiging om van vorm te veranderen, het een van de moeilijkste doelen voor voorspelling maakt.

De implicaties van deze bevindingen zijn diepgaand voor de toekomst van de medicijnontwikkeling. Door een helder, hoogwaardig beeld te geven van hoe CYP3A4 daadwerkelijk beweegt en bindt aan verschillende moleculen, biedt dit werk een nieuwe set grondwaarheden waar wetenschappers van kunnen leren. De onderzoekers suggereren dat het routinematig gebruik van cryo-EM om deze interacties in kaart te brengen, de noodzakelijke gegevens zal leveren om betere computermodellen te trainen. Tot nu toe vertrouwde het vakgebied op een beperkte set statische kristalstructuren die de belangrijkste gedragingen van het enzym vaak missen. Met het vermogen om het enzym in zijn vele vormen te zien, kunnen wetenschappers beginnen met het bouwen van voorspellende instrumenten die werkelijk nuttig zijn, wat helpt om interacties tussen medicijnen en metabole problemen te voorzien voordat een nieuw medicijn ooit een patiënt bereikt. De studie beweert niet het probleem van het voorspellen van medicijnmetabolisme te hebben opgelost, maar heeft de weg naar voren verlicht, door te laten zien dat om deze complexe poortwachter te begrijpen, we moeten stoppen met hem te zien als een rigide standbeeld en moeten beginnen hem te zien als de flexibele, verschuivende machine die hij werkelijk is.