Micro-C-TALE: BAC-based targeted high-resolution measurement of 3D chromatin interactions

داخل نواة كل خلية بشرية، لا يكون الحمض النووي (DNA) مجرد تشابك عشوائي، بل بنية منظمة بإحكام، مطوية ومعبأة بطرق محددة تحدد أي الجينات تكون نشطة وأيها تكون صامتة. يعمل هذا الترتيب ثلاثي الأبعاد كنظام تحكم معقد، حيث يجمع أجزاء بعيدة من الشفرة الوراثية لتصبح في تقارب وثيق حتى تتمكن من التواصل فيما بينها. لطالما استخدم العلماء تقنية تسمى "التقاط تكوين الكروموسومات" لرسم خرائط هذه العلاقات المكانية، وهي في الأساس عملية التقاط صورة لكيفية تلامس وتفاعل أقسام مختلفة من الحمض النووي. وبينما كشفت هذه الطرق عن سمات واسعة للتنظيم الجينومي، مثل النطاقات الكبيرة والمقصورات العامة، ظل التقاط رؤية تفصيلية عالية الدقة لمنطقة صغيرة ومحددة أمرًا صعبًا. تتطلب هذه العملية تسلسل كميات هائلة من البيانات للعثور على الروابط النادرة بين نقاط محددة، مما يجعلها مكلفة وغير فعالة لدراسة التفاصيل الدقيقة دون الحاجة للنظر إلى الجينوم بأكمله في آن واحد.

ولحل هذه المشكلة، طور باحثون في معهد التخنيون في إسرائيل طريقة جديدة تسمى "Micro-C-TALE"، صُممت لتسليط الضوء على أحياء جينومية محددة بوضوح غير مسبوق. تجمع هذه التقنية بين نهجين قائمين: أحدهما يكسر الحمض النووي إلى قطع صغيرة متساوية باستخدام إنزيم يقطع بين الوحدات الأساسية للكروماتين، والآخر يستخدم قطعًا طبيعية كبيرة من الحمض النووي من مستنسخات بكتيرية لاصطياد المناطق المراد دراستها فقط. ومن خلال دمج هاتين الاستراتيجيتين، ابتكر الفريق طريقة لإنشاء خرائط تفاعل مفصلة لمنطقة مختارة دون الحاجة إلى تصنيع مجسات كيميائية مخصصة أو تسلسل الجينوم بأكمله. وقد اختبروا هذه الطريقة على منطقة تبلغ 214 كيلوبايز من الحمض النووي البشري، وهي قطعة تعادل تقريبًا حجم كتلة مدينة صغيرة في المشهد الجيني، ووجدوا أنها قادرة على كشف سمات هيكلية معقدة فاتتها الطرق الأخرى.

طبق الباحثون طريقتهم الجديدة على الخلايا البشرية، حيث قاموا أولاً برسم خريطة لمنطقة محددة لمعرفة نوع التفاصيل التي يمكنهم تحقيقها. أنتجوا خريطة توضح كيفية تفاعل أجزاء مختلفة من هذا الجزء من الحمض النووي مع بعضها البعض، وكانت النتائج مذهلة. فبالمقارنة مع الخرائط القياسية لنفس المنطقة، والتي بدت مشوشة وضبابية عند هذا المستوى من التكبير، أظهرت خريطة "Micro-C-T_ALE" هياكل واضحة وحادة. لقد كشفت عن حدود متميزة ونقاط محددة حيث تلتف خيوط الحمض النووي معًا، مدعومة ببروتين يُعرف باسم "CTCF" يعمل مثل دبوس جزيئي يثبت هذه العراوي في مكانها. كانت هذه التفاصيل الدقيقة مرئية على الرغم من أن الفريق استخدم قدرة تسلسل أقل بكثير مما يتطلبه عادةً للدراسات واسعة النطاق للجينوم، مما أثبت أن الطريقة يمكنها استخراج كثافة عالية من المعلومات المفيدة من كمية متواضدة من البيانات.

ولإثبات أن الطريقة كانت حساسة بما يكفي لاكتشاف التغييرات الطفيفة، استخدم العلماء أدوات تحرير الجينات لإدخال موقع ارتباط واحد جديد لبروتين "CTCF" في منتصف المنطقة المستهدفة. كان هذا التعديل "متباين الزيجوت" (heterozygous)، مما يعني أن نسخة واحدة فقط من نسختي الجين في الخلية تحمل التغيير، وهو ما أدى فعليًا إلى خفض قوة الإشارة لأي تفاعلات جديدة تتشكل. وعندما رسموا خريطة لهذه المنطقة المعدلة، نجحت تقنية "Micro-C-TALE" في اكتشاف ظهور عراوي جديدة تربط الموقع المُدخل بنقاط الارتكاز الموجودة. كانت هذه الاتصالات بالكاد مرئية عندما استخدم الفريق نسخة قديمة من التقنية تعتمد على إنزيم التقييد على نفس الخلايا. فشلت الطريقة القديمة في إظهار العراوي الجديدة بوضوح، حتى بعد تسلسل كمية أكبر بكثير من البيانات، مما يشير إلى أن النهج الجديد أكثر كفاءة في التقاط هذه التفاعلات الدقيقة والحساسة.

يكمن نجاح "Micro-C-TALE" في قدرتها على تجاوز الحاجة إلى مجسات كيميائية مخصصة ومكلفة. فبدلاً من تصميم وتصنيع قليل من قليلات النيوكليوتيدات لكل تجربة، استخدم الفريق حمضًا نوويًا من كروموسومات اصطناعية بكتيرية، وهي قطع كبيرة ومستقرة من الحمض النووي تغطي المنطقة المعنية بشكل طبيعي. تم تقطيع هذه المستنسخات البكتيرية لإنشاء مجموعة من المجسات التي يمكن إعادة استخدامها وتضخيمها، مما يوفر طريقة مرنة ومنخفضة التكلفة لاستهداف مناطق جينومية محددة. ومن خلال إلغاء خطوة وسم البيوتين وسحب روابط الربط باستخدام الستربتافيدين، وهي عملية يمكن أن تؤدي أحيانًا إلى فقدان بعض التعقيد القيمة، واستخدام اختيار الحجم لتصفية النتائج، حافظ الباحثون على تنوع غني من التفاعلات. يسمح هذا النهج للعلماء باستقصاء كيفية استجابة بنية الجينوم للتغيرات الجينية بمستوى من التفصيل كان في السابق صعب المنال تقنيًا أو مكلفًا للغاية، مما يفتح الباب أمام فهم أعمق لكيفية تأثير التنظيم ثلاثي الأبعاد للحمض النووي على الوظيفة الخلوية.