Micro-C-TALE: BAC-based targeted high-resolution measurement of 3D chromatin interactions

모든 인간 세포의 핵 내부에서 DNA는 느슨하게 엉킨 타래가 아니라, 어떤 유전자가 활성화되고 어떤 유전자가 침묵할지를 결정하는 특정한 방식으로 접히고 채워진 정교하게 조직된 구조체입니다. 이 3차원적 배열은 복잡한 제어 시스템 역할을 하며, 유전 암호의 서로 떨어진 부분들을 가까이 가져와 서로 소통할 수 있게 합니다. 과학자들은 이러한 공간적 관계를 지도화하기 위해 염색체 구조 포착(chromosome conformation capture)이라는 기술을 오랫동안 사용해 왔으며, 이는 본질적으로 서로 다른 DNA 구역들이 어떻게 맞닿고 상호작용하는지를 보여주는 스냅샷을 찍는 것과 같습니다. 이러한 방법들은 거대한 도메인이나 일반적인 구획과 같은 게놈 구조의 광범위한 특징들을 밝혀냈지만, 특정하고 작은 영역에 대한 상세하고 고해상도의 시야를 확보하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있었습니다. 이 과정은 특정 지점 사이의 희귀한 연결을 찾기 위해 방대한 양의 데이터를 시퀀싱해야 하므로, 전체 게놈을 한꺼번에 보지 않고 미세한 세부 사항을 연구하는 것은 비용이 많이 들고 비효율적입니다.

이 문제를 해결하기 위해 이스라엘 테크니온 공대의 연구진은 전례 없는 명확함으로 특정 게놈 인근 지역을 확대해 볼 수 있도록 설계된 'Micro-C-TALE'이라는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 기술은 두 가지 기존 접근 방식을 결합합니다. 하나는 크로마틴의 기본 단위 사이를 절단하는 효소를 사용하여 DNA를 매우 작고 균일한 조각으로 분해하는 방식이고, 다른 하나는 박테리아 클론으로부터 유래한 커다란 천연 DNA 조각을 사용하여 관심 영역만을 낚아 올리는 방식입니다. 이 두 전략을 병합함으로써, 연구팀은 맞춤형 화학 프로브를 합성하거나 전체 게놈을 시퀀싱할 필요 없이 선택된 영역의 상세한 상호작용 지도를 생성할 수 있는 방법을 만들어냈습니다. 연구진은 이 방법을 인간 DNA의 214킬로베이스(kb) 영역, 즉 유전적 경관에서 작은 도시 한 블록 정도의 크기에 해당하는 구간에 테스트하였으며, 이 방법이 기존의 다른 방식들이 놓쳤던 복잡한 구조적 특징들을 드러낼 수 있음을 확인했습니다.

연구진은 이 새로운 방법을 인간 세포에 적용하여, 먼저 특정 영역을 매핑함으로써 어떤 수준의 세부 사항을 달성할 수 있는지 확인했습니다. 그들은 이 DNA 단편의 서로 다른 부분들이 어떻게 상호작용하는지를 보여주는 지도를 제작했으며, 그 결과는 놀라웠습니다. 동일한 영역에 대한 표준 지도와 비교했을 때, 표준 지도는 이 정도 배율에서는 노이즈가 많고 흐릿하게 나타났으나, Micro-C-TALE 지도는 명확하고 선명한 구조를 보여주었습니다. 이 지도는 DNA 가닥이 서로 루프를 형성하며 결합하는 뚜렷한 경계와 특정 지점들을 드러냈으며, 이 루프들은 분자 스테이플처럼 루프를 고정하는 역할을 하는 CTCF라는 단백질에 의해 고정되어 있었습니다. 이러한 미세한 세부 사항들은 연구팀이 게놈 전체 연구에 통상적으로 요구되는 것보다 훨씬 적은 양의 시퀀싱 파워를 사용했음에도 불구하고 관찰되었으며, 이는 이 방법이 적은 양의 데이터로부터 높은 밀도의 유용한 정보를 추출할 수 있음을 입증했습니다.

이 방법이 미세한 변화를 감지할 만큼 민감한지를 증명하기 위해, 과학자들은 유전자 편집 도구를 사용하여 표적 영역 중간에 CTCF 단백질의 새로운 결합 부위 하나를 삽입했습니다. 이 변형은 이형접합(heterozygous) 방식으로 이루어졌는데, 이는 세포 내 두 개의 유전자 복사본 중 하나에만 변화가 생겼음을 의미하며, 결과적으로 새로 형성된 상호작용의 신호 강도를 절반으로 줄이는 효과를 냈습니다. 편집된 영역을 매핑했을 때, Micro-C-TALE은 삽입된 부위가 기존의 닻(anchor) 지점들과 연결되는 새로운 루프의 출현을 성공적으로 감지해 냈습니다. 이 새로운 연결들은 연구팀이 동일한 세포에 대해 기존의 제한 효소 기반 기술을 사용했을 때는 거의 보이지 않았던 것들입니다. 기존 방식은 훨씬 더 많은 양의 데이터를 시퀀싱했음에도 불구하고 새로운 루프를 명확하게 보여주는 데 실패했으며, 이는 새로운 접근 방식이 이러한 섬세하고 미세한 상호작용을 포착하는 데 훨씬 더 효율적임을 시사합니다.

Micro-C-TALE의 성공은 값비싼 맞춤형 화학 프로브를 사용할 필요를 없앤 능력에 있습니다. 매 실험마다 새로운 올리고뉴클레오타이드를 설계하고 합성하는 대신, 연구팀은 관심 영역을 자연스럽게 덮고 있는 크고 안정적인 DNA 조각인 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosomes)를 사용했습니다. 이 박테리아 클론들은 프로브 역할을 할 수 있는 풀(pool)을 만들기 위해 잘게 쪼개졌으며, 이는 재사용 및 증폭이 가능한 유연하고 비용 효율적인 방식으로 특정 게놈 영역을 타겟팅할 수 있게 해주었습니다. 또한, 결합 접합부(ligation junctions)의 바이오틴 라벨링과 스트렙타비딘 풀다운(streptavidin pull-down) 단계를 생략하고 대신 크기 선택(size selection)을 통해 결과를 필터링함으로써, 연구진은 풍부한 다양한 상호작용을 보존할 수 있었습니다. 이러한 접근 방식은 과학자들이 유전적 변화에 따라 게놈 구조가 어떻게 반응하는지를 이전에는 너무 비용이 많이 들거나 기술적으로 어려웠던 수준의 세밀함으로 조사할 수 있게 해줍니다. 이는 DNA의 3차원적 조직이 세포 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 더 깊은 이해를 위한 길을 열어줍니다.