Micro-C-TALE: BAC-based targeted high-resolution measurement of 3D chromatin interactions

あらゆるヒト細胞の核内において、DNAは単なる緩んだもつれではなく、どの遺伝子が活性化し、どの遺伝子が沈黙しているかを決定する特定の様式で折り畳まれ、詰め込まれた、緻密に構成された構造体となっています。この三次元的な配置は複雑な制御システムとして機能し、遺伝コードの離れた部分を近接させ、それらが通信できるようにしています。科学者たちは長い間、染色体コンフォメーションキャプチャと呼ばれる技術を用いて、これらの空間的関係をマッピングしてきました。これは、本質的には、異なるDNAセクションがどのように接触し、相互作用しているかのスナップショットを撮る手法です。これらの手法は、大きなドメインや一般的なコンパートメントといったゲノム組織の広範な特徴を明らかにしてきましたが、特定の小さな領域に対して詳細かつ高解像度な視点を得ることは依然として困難でした。そのプロセスには、特定の点の間にある稀な接続を見つけ出すために膨大な量のデータをシーケンシングする必要があり、ゲノム全体を一度に見ることなく微細な詳細を研究することは、コストがかかり非効率的でした。

この問題を解決するために、イスラエルのテクニオンの研究者たちは、前例のない明快さで特定のゲノム領域をズームアップするように設計された、Micro-C-TALEと呼ばれる新しい手法を開発しました。この技術は、既存の二つのアプローチを組み合わせています。一つは、クロマチンの基本単位の間を切断する酵素を用いて、DNAを非常に小さく均一な断片に分解する手法であり、もう一つは、細菌クローン由来の大きな天然DNA断片を用いて、関心のある領域のみを釣り上げる手法です。これらの戦略を融合させることで、チームは、カスタムの化学プローブを合成したりゲノム全体をシーケンシングしたりすることなく、選択された領域の詳細な相互作用マップを作成する方法を生み出しました。彼らはこの手法を、ヒトDNAの214キロベースの領域（遺伝的な景観における小さな街区の大きさに相当するセグメント）でテストし、他の手法が見逃してしまうような複雑な構造的特徴を明らかにできることを見出しました。

研究者たちは、どのような詳細度を達成できるかを確認するために、まず特定の領域をマッピングして、この新しい手法をヒト細胞に適用しました。彼らは、このDNAセグメントの異なる部分が互いにどのように相互作用しているかを示すマップを作成しましたが、その結果は驚くべきものでした。同じ領域の標準的なマップと比較すると、標準的なマップはこの倍率レベルではノイズが多くぼやけて見えましたが、Micro-C-TALEのマップは、明瞭で鮮明な構造を示していました。それは、DNA鎖がループ状に結合する明確な境界と特定の地点を明らかにしました。これらのループは、分子的なステープル（ホッチキス）のようにループを固定する役割を果す、CTCFとして知られるタンパク質によって固定されています。これらの微細な詳細は、ゲノムワイドな研究で通常必要とされるよりも大幅に少ないシーケンシングパワーを使用していたにもかかわらず可視化されており、この手法が適度な量のデータから高密度で有用な情報を抽出できることを実証しました。

この手法が微細な変化を検出するのに十分な感度を持っていることを証明するため、科学者たちは遺伝子編集ツールを使用して、標的領域の中央にCTCFタンパク質の結合部位を一つ新たに挿入しました。この改変はヘテロ接合体で行われました。つまり、細胞内の二つのコピーのうち一方の遺伝子のみが変化を保持しているため、新たに形成された相互作用の信号強度が事実上半分になるように設計されました。彼らがこの編集された領域をマッピングしたところ、Micro-C-TALEは、挿入された部位と既存のアンカーポイントを結ぶ新しいループの出現を正常に検出しました。これらの新しい接続は、チームが同じ細胞に対して古い制限酵素ベースの手法を用いた際には、ほとんど目視できませんでした。古い手法は、より大量のデータをシーケンシングした後でも、新しいループを明確に示すことができず、このことは新しいアプローチが、これらの繊細で微細な相互作用を捉える上で極めて効率的であることを示唆しています。

Micro-C-TALEの成功は、高価でカスタムメイドの化学プローブを必要とせずに済む能力にあります。実験ごとに新しいオリゴヌクレオチドを設計・合成する代わりに、チームは、関心のある領域を自然にカバーしている、安定した大きなDNA断片である細菌人工染色体を使用しました。これらの細菌クローンは、プローブのプールを作成するために細かく切り分けられ、再利用および増幅が可能であり、特定のゲノム領域を標的にするための柔軟かつ費用対効果の高い方法を提供しました。ビオチン標識やリゲーション接合部のストレプトアビジンによるプルダウン（これは時に貴重な複雑性を失わせることがあるプロセスです）のステップを省略し、代わりにサイズ選択を用いて結果をフィルタリングすることで、研究者たちは多様な相互作用を保持することに成功しました。このアプローチにより、科学者は、ゲノムの構造が遺伝的変化にどのように反応するかを、以前はあまりにコストがかかるか技術的に困難であった詳細度で調査することが可能になり、DNAの三次元的な組織化がいかに細胞機能に影響を与えるかという、より深い理解への扉を開きました。