Micro-C-TALE: BAC-based targeted high-resolution measurement of 3D chromatin interactions

प्रत्येक मानव कोशिका के केंद्रक (न्यूक्लियस) के भीतर, डीएनए एक ढीले उलझाव के रूप में नहीं, बल्कि एक सुव्यवस्थित संरचना के रूप में होता है, जो विशिष्ट तरीकों से मुड़ा और पैक किया गया है जो यह निर्धारित करते हैं कि कौन से जीन सक्रिय हैं और कौन से शांत। यह त्रि-आयामी व्यवस्था एक जटिल नियंत्रण प्रणाली के रूप में कार्य करती है, जो आनुवंशिक कोड के दूरस्थ हिस्सों को एक-दूसरे के करीब लाती है ताकि वे संवाद कर सकें। वैज्ञानिकों ने इन स्थानिक संबंधों का मानचित्रण करने के लिए लंबे समय से 'क्रोमोसोम कॉन्फ़िगरेशन कैप्चर' नामक तकनीक का उपयोग किया है, जो अनिवार्य रूप से इस बात का स्नैपशॉट लेती है कि डीएनए के विभिन्न भाग एक-दूसरे को कैसे छूते हैं और परस्पर क्रिया करते हैं। जबकि इन विधियों ने जीनोम संगठन की व्यापक विशेषताओं, जैसे कि बड़े डोमेन और सामान्य कंपार्टमेंट्स को उजागर किया है, एक विशिष्ट, छोटे क्षेत्र का विस्तृत, उच्च-रिज़ॉल्यूशन दृश्य प्राप्त करना कठिन बना हुआ है। इस प्रक्रिया के लिए विशिष्ट बिंदुओं के बीच दुर्लभ कनेक्शन खोजने के लिए डेटा की विशाल मात्रा को अनुक्रमित (सीक्वेंसिंग) करने की आवश्यकता होती है, जिससे पूरे जीनोम को एक साथ देखे बिना सूक्ष्म विवरणों का अध्ययन करना महंगा और अक्षम हो जाता है।

इस समस्या को हल करने के लिए, इज़राइल के टेक्नियन के शोधकर्ताओं ने 'माइक्रो-सी-टेल' (Micro-C-TALE) नामक एक नई विधि विकसित की है, जिसे अभूतपूर्व स्पष्टता के साथ विशिष्ट जीनोमिक पड़ोस पर ज़ूम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह तकनीक दो मौजूदा दृष्टिकोणों को जोड़ती है: एक जो क्रोमैटिन की बुनियादी इकाइयों के बीच कटने वाले एंजाइम का उपयोग करके डीएनए को बहुत छोटे, समान टुकड़ों में तोड़ता है, और दूसरा जो केवल रुचि के क्षेत्रों को बाहर निकालने के लिए बैक्टीरिया के क्लोन से प्राप्त बड़े, प्राकृतिक डीएनए खंडों का उपयोग करता है। इन रणनीतियों को मिलाकर, टीम ने एक तरीका बनाया जिससे कस्टम रासायनिक प्रोब (probes) को संश्लेषित किए बिना या पूरे जीनोम को अनुक्रमित किए बिना, एक चयनित क्षेत्र का विस्तृत इंटरैक्शन मैप तैयार किया जा सके। उन्होंने इस विधि का परीक्षण मानव डीएनए के 214-किलोबेस क्षेत्र पर किया, जो आनुवंशिक परिदृश्य में एक छोटे शहर के ब्लॉक के आकार के लगभग बराबर है, और पाया कि यह उन जटिल संरचनात्मक विशेषताओं को प्रकट कर सकता है जिन्हें अन्य विधियाँ चूक जाती हैं।

शोधकर्ताओं ने अपनी नई विधि को मानव कोशिकाओं पर लागू किया, सबसे पहले एक विशिष्ट क्षेत्र का मानचित्रण किया ताकि वे देख सकें कि वे किस स्तर का विवरण प्राप्त कर सकते हैं। उन्होंने एक ऐसा मानचित्र तैयार किया जो दिखाया कि इस डीएनए खंड के विभिन्न हिस्से एक-दूसरे के साथ कैसे परस्पर क्रिया करते हैं, और परिणाम आश्चर्यजनक थे। उसी क्षेत्र के मानक मानचित्रों की तुलना में, जो इस आवर्धन स्तर पर शोर युक्त और धुंधले दिखाई देते थे, माइक्रो-सी-टेल मानचित्र ने स्पष्ट, तीक्ष्ण संरचनाएं दिखाईं। इसने स्पष्ट सीमाओं और उन विशिष्ट बिंदुओं को प्रकट किया जहाँ डीएनए स्ट्रैंड्स एक साथ लूप बनाते हैं, जो 'सीटीएफ' (CTCF) नामक प्रोटीन द्वारा एंकर किए गए हैं, जो लूप को अपनी जगह पर बनाए रखने वाले एक आणविक स्टेपल की तरह कार्य करता है। ये सूक्ष्म विवरण स्पष्ट रूप से दिखाई दिए, भले ही टीम ने जीनोम-व्यापी अध्ययनों के लिए आवश्यक तुलनात्मक रूप से काफी कम सीक्वेंसिंग शक्ति का उपयोग किया था, जो यह दर्शाता है कि यह विधि डेटा की एक सीमित मात्रा से भी उच्च घनत्व वाली उपयोगी जानकारी निकाल सकती है।

यह सिद्ध करने के लिए कि यह विधि सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील थी, वैज्ञानिकों ने जीन-एडिटिंग टूल्स का उपयोग करके लक्षित क्षेत्र के मध्य में सीटीएफ प्रोटीन के लिए एक नया बाइंडिंग साइट डाला। यह 'हेटरोजीगस' (heterozygous) था, जिसका अर्थ है कि कोशिका में जीन की दो प्रतियों में से केवल एक में परिवर्तन था, जिसने प्रभावी रूप से नए बने इंटरैक्शन की सिग्नल स्ट्रेंथ को आधा कर दिया। जब उन्होंने इस संपादित क्षेत्र का मानचित्रण किया, तो माइक्रो-सी-टेल ने मौजूदा एंकर पॉइंट्स से जुड़े नए लूप्स के उद्भव का सफलतापूर्वक पता लगा लिया। ये नए कनेक्शन पुराने, 'रेस्ट्रिक्शन-एंजाइम' आधारित संस्करण के उपयोग के बाद भी मुश्किल से दिखाई दे रहे थे, जिसे टीम ने उन्हीं कोशिकाओं पर आजमाया था। पुराना तरीका, बहुत अधिक डेटा अनुक्रमित करने के बाद भी, नए लूप्स को स्पष्ट रूप से दिखाने में विफल रहा, जो यह सुझाव देता है कि नया दृष्टिकोण इन नाजुक, सूक्ष्म-स्तरीय इंटरैक्शन को पकड़ने में कहीं अधिक कुशल है।

माइक्रो-सी-टेल की सफलता महंगे, कस्टम-मेड रासायनिक प्रोब्स की आवश्यकता को दरकिनार करने की इसकी क्षमता में निहित है। प्रत्येक प्रयोग के लिए नए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को डिजाइन और संश्लेषित करने के बजाय, टीम ने 'बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोसोम' से डीएनए का उपयोग किया, जो बड़े, स्थिर डीएनए खंड हैं जो स्वाभाविक रूप से रुचि के क्षेत्र को कवर करते हैं। इन बैक्टीरियल क्लोन को प्रोब्स का एक पूल बनाने के लिए विभाजित किया गया था जिन्हें पुन: उपयोग और प्रवर्धित (एम्प्लीफाई) किया जा सकता था, जो विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों को लक्षित करने का एक लचीला और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है। लाइगेशन जंक्शनों के बायोटिन लेबलिंग और स्ट्रैप्टाविडिन पुल-डाउन (एक ऐसी प्रक्रिया जिसमें कभी-कभी मूल्यवान जटिलता खो सकती है) के चरण को छोड़कर, और इसके बजाय परिणामों को फ़िल्टर करने के लिए 'साइज़ सिलेक्शन' का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने विविध इंटरैक्शन को संरक्षित किया। यह दृष्टिकोण वैज्ञानिकों को यह जांचने की अनुमति देता है कि जीनोम की संरचना आनुवंशिक परिवर्तनों के प्रति कैसे प्रतिक्रिया करती है, और वह भी उस स्तर के विवरण के साथ जो पहले बहुत महंगा या तकनीकी रूप से कठिन था, जिससे डीएनए के त्रि-आयामी संगठन के कोशिकीय कार्य को कैसे प्रभावित करता है, इसकी गहरी समझ का मार्ग प्रशस्त होता है।