CRISPR/Cas9-mediated multicopy δ-site integration in Saccharomyces cerevisiae via Cas9 expression
تقدم هذه الدراسة استراتيجية مُحسّنة لنظام CRISPR/Cas9 تستخدم التعبير المستحث لبروتين Cas9 وتقليل عدد نسخ البلازميد للحد من تلف الحمض النووي والسمية، مما يتيح التكامل الفعال لنسخ متعددة من الجينات غير المتجانسة في مواقع δ في جينوم خميرة السكر (*Saccharomyces cerevisiae*).
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
تخيل عالماً حيث لا تُعد الكائنات الحية وحيدة الخلية الصغيرة مجرد كائنات حية، بل هي أيضاً مصانع مجهرية. لقد عرف العلماء منذ فترة طويلة كيفية برمجة خلايا الخميرة هذه لإنتاج مواد مفيدة، من الأدوية إلى الوقود الحيوي. ولجعل هذه المصانع فعالة، يحتاج الباحثون غالباً إلى إدخال تعليمات جينية جديدة في الحمض النووي للخميرة. ويكمن التحدي في جعل تلك التعليمات تلتصق بأعداد كبيرة. تمتلك خلايا الخميرة ميزة طبيعية في شفرتها الجينية: وهي تسلسلات متكررة طويلة منتشرة في جميع أنحاء جينومها. تعمل هذه التكرارات مثل أبواب مفتوحة متعددة يمكن إدخال المادة الجينية الجديدة من خلالها. وإذا استطاع عالم ما فتح كل هذه الأبواب في وقت واحد، فيمكنه حشد نسخ عديدة من جين مفيد داخل الخلية، محولاً الخميرة إلى منتج عالي الحجم.
ومع ذلك، فإن فتح الكثير من الأبواب في وقت واحد قد يكون خطيراً. فالأداة المستخدمة لقص هذه الأبواب الجينية هي مقص جزيئي يُسمى CRISPR/Cas9. وعندما حاول العلماء استخدام هذه الأداة لقص كل هذه الأبواب المتكررة في آن واحد، ماتت خلايا الخميرة. كانت القطوع كثيرة جداً، مما أدى إلى إرهاق قدرة الخلية على الإصلاح. لقد كانت حالة كلاسيكية لمحاولة القيام بالكثير بسرعة كبيرة. وأصبح السؤال: كيف يمكننا استخدام هذه الأداة القوية لصنع نسخ عديدة من جين دون قتل المصنع في هذه العملية؟
سعى فريق من الباحثين لحل هذه المشكلة من خلال تحسين كيفية إيصال المقص الجزيئي إلى الخميرة. بدأوا بنهج قياسي، حيث قاموا بتعبئة تعليمات المقص والدليل الذي يخبره بمكان القص على قطعة صغيرة دائرية من الحمض النووي التي يمكن للخميرة حملها. صُممت قطعة الحمض النووي هذه لتتكاثر مرات عديدة داخل الخلية، مما يضمن وجود الكثير من أدوات القص. وعندما أدخلوا هذا الإعداد إلى الخميرة مع المادة الجينية الجديدة التي أرادوا إدخالها، كانت النتيجة فشلاً ذريعاً. لم تنجُ أي خلايا خميرة حية من هذه العملية. فالحجم الهائل للقطوع التي أحدثتها المقصات الوفيرة كان أكبر مما يمكن للخلايا تحمله، مما تسبب في أضرار قاتلة لشفرتها الجينية.
أدرك الباحثون أن المشكلة تكمن في شدة عملية القص. لذا جربوا تعديلاً أولياً: بدلاً من جعل الخميرة تنتج المقصات باستمرار، انتقلوا إلى نظام يمكن فيه تشغيل الإنتاج وإيقافه. صمموا التعليمات بحيث لا يتم إنتاج المقصات إلا عندما يتم تغذية الخميرة بسكر محدد يسمى الجالاكتوز، وتظل خاملة عند تغذيتها بالجلوكوز. كانت الفكرة هي ترك الخميرة تنمو بقوة أولاً، ثم تحفيز عملية القص فقط عندما تكون المادة الجينية الجديدة جاهزة للإدخال. ومع ذلك، حتى مع وجود هذا المفتاح، لا تزال الخميرة تموت. فقد تبين أن مفتاح "الإيقاف" لم يكن محكماً بما يكفي؛ إذ كان هناك كمية ضئيلة من المقصات تُنتج في الخلفية، وكانت هذه التسربة البسيطة كافية للتسبب في الضرر القاتل عند استهداف مواقع عديدة في آن واحد.
جاء الاختراق عندما غير الباحثون حجم وسيلة الإيصال نفسها. فبدلاً من استخدام قطعة حمض نووي دائرية تتضاعف مرات عديدة داخل الخلية، استبدلوها بأخرى تبقى كنسخة واحدة مستقرة. ومن خلال تقليل عدد نسخ أداة القص من نسخ عديدة إلى نسخة واحدة فقط، خفضوا بشكل كبير إجمالي كمية المقصات المنتجة. كان هذا التغيير البسيط هو مفتاح النجاح. فعندما استخدموا هذه النسخة منخفضة التكرار، نجت خلايا الخميرة. وقد نجحوا في دمج المادة الجينية الجديدة في الأجزاء المتكررة من جينومها.
وللتأكد من أن الجينات الجديدة قد استقرت، أضاف الباحثون علامة مضيئة إلى الحزمة الجينية. فعندما دمجت خلايا الخميرة الحمض النووي الجديد بنجاح، بدأت في التوهج بضوء أحمر. وتحت المجهر، رأى الفريق أن بعض مستعمرات الخميرة كانت تتوهج بسطوع وثبات، مما أثبت أن الجينات الجديدة لم تكن موجودة فحسب، بل كانت مستقرة أيضاً أثناء انقسام الخلايا. ورغم أن كل خلية في كل مستعمرة لم تكن تتوهج، إلا أن وجود هذه المستعمرات الصحية والمتوهجة أظهر أن الطريقة قد نجحت. لقد أثبتت الدراسة أنه لكي يتم تعديل مواقع متعددة في الجينوم في وقت واحد، يجب موازنة قوة أداة التعديل بعناية. ومن خلال إبقاء كمية الأداة منخفضة والتحكم بدقة في وقت نشاطها، يمكن للعلماء الآن إجراء ترقيات جينية معقدة للخميرة دون تدمير الخلايا التي يحاولون تحسينها. يفتح هذا النهج الباب أمام إنشاء سلالات خميرة أكثر قوة وإنتاجية للاستخدام الصناعي، محولاً عملية كانت مميتة سابقاً إلى تقنية هندسية دقيقة وقابلة للإدارة.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.