CRISPR/Cas9-mediated multicopy δ-site integration in Saccharomyces cerevisiae via Cas9 expression
यह अध्ययन *Saccharomyces cerevisiae* जीनोम के δ-साइट्स में हेटेरोलॉगस जीन के कुशल मल्टीकॉपी एकीकरण को सक्षम करने के लिए, डीएनए क्षति और विषाक्तता को कम करने हेतु इंड्यूसिबल Cas9 अभिव्यक्ति और कम प्लाज्मिड कॉपी संख्या का उपयोग करते हुए एक अनुकूलित CRISPR/Cas9 रणनीति प्रस्तुत करता है।
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एक ऐसी दुनिया की कल्पना करें जहाँ सूक्ष्म, एककोशिकीय जीव न केवल जीवित प्राणी हैं, बल्कि सूक्ष्म कारखाने भी हैं। वैज्ञानिक लंबे समय से जानते हैं कि इन यीस्ट (yeast) कोशिकाओं को उपयोगी पदार्थों, जैसे कि दवाओं से लेकर जैव ईंधन तक, का उत्पादन करने के लिए कैसे प्रोग्राम किया जा सकता है। इन कारखानों को कुशल बनाने के लिए, शोधकर्ताओं को अक्सर यीस्ट के डीएनए में नए आनुवंशिक निर्देश डालने की आवश्यकता होती है। चुनौती उन निर्देशों को बड़ी संख्या में स्थापित करने की है। यीस्ट कोशिकाओं के अपने जेनेटिक कोड में एक स्वाभाविक विशेषता है: उनके जीनोम में बिखरी हुई लंबी, दोहराव वाली अनुक्रम (sequences)। ये दोहराव नई आनुवंशिक सामग्री को डाला जा जाने के लिए कई खुले दरवाजों की तरह कार्य करते हैं। यदि कोई वैज्ञानिक इन सभी दरवाजों को एक साथ खोल सके, तो वे कोशिका में कई कॉपियाँ एक उपयोगी जीन की भर सकते हैं, जिससे यीस्ट एक उच्च-मात्रा वाले उत्पादक में बदल जाएगा।
हालाँकि, एक साथ बहुत अधिक दरवाजे खोलना खतरनाक हो सकता है। इन आनुवंशिक दरवाजों को काटने के लिए उपयोग किया जाने वाला उपकरण एक आणविक कैंची है जिसे CRISPR/Cas9 कहा जाता है। जब वैज्ञानिकों ने इन दोहराव वाले दरवाजों को एक साथ काटने के लिए इस उपकरण का उपयोग करने की कोशिश की, तो यीस्ट कोशिकाएं मर गईं। कट बहुत अधिक थे, जिसने क्षति को ठीक करने की कोशिका की क्षमता को थका दिया था। यह बहुत अधिक और बहुत तेज़ी से करने का एक क्लासिक मामला था। सवाल यह बन गया कि हम कोशिका को नष्ट किए बिना एक जीन की कई कॉपियाँ बनाने के लिए इस शक्तिशाली उपकरण का उपयोग कैसे कर सकते हैं?
शोधकर्ताओं की एक टीम ने आणविक कैंची को यीस्ट तक पहुँचाने के तरीके को परिष्कृत करके इस समस्या को हल करने का प्रयास किया। उन्होंने एक मानक दृष्टिकोण से शुरुआत की, जिसमें कैंची के निर्देशों और उस गाइड को जो उन्हें बताती है कि कहाँ काटना है, एक छोटे, गोलाकार डीएनए (DNA) के टुकड़े पर पैक किया गया जिसे यीस्ट ले जा सके। इस डीएनए के टुकड़े को इस तरह डिज़ाइन किया गया था कि वह कोशिका के भीतर कई बार प्रतिकृति (replicate) बना सके, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि काटने वाले उपकरण की बड़ी मात्रा उपलब्ध है। जब उन्होंने इस सेटअप को नए आनुवंशिक पदार्थ के साथ यीस्ट में पेश किया जिसे वे डालना चाहते थे, तो परिणाम पूरी तरह से विफल रहा। कोई भी जीवित यीस्ट कोशिका प्रक्रिया में जीवित नहीं बची। कैंची की प्रचुर मात्रा द्वारा बनाए गए कट्स की भारी संख्या ने कोशिकाओं को संभाल पाने की क्षमता से अधिक नुकसान पहुँचाया, जिससे उनके आनुवंशिक कोड को घातक क्षति हुई।
शोधकर्ताओं को एहसास हुआ कि समस्या काटने की तीव्रता में थी। उन्होंने पहला समायोजन किया: यीस्ट द्वारा लगातार कैंची बनाने के बजाय, उन्होंने एक ऐसी प्रणाली में बदलाव किया जहाँ उत्पादन को चालू और बंद किया जा सके। उन्होंने निर्देशों को इस तरह डिज़ाइन किया कि कैंची केवल तभी बनाई जाएगी जब यीस्ट को गैलेक्टोज (galactose) नामक एक विशिष्ट चीनी खिलाई जाएगी, और ग्लूकोज खिलाने पर निष्क्रिय रहेगी। विचार यह था कि पहले यीस्ट को मजबूत होने दिया जाए, और फिर नया आनुवंशिक पदार्थ डालने के लिए कटिंग को ट्रिगर किया जाए। फिर भी, इस स्विच के साथ भी, यीस्ट मर गया। यह पता चला कि "ऑफ" स्विच पर्याप्त सटीक नहीं था; कैंची की एक छोटी, पृष्ठभूमि (background) मात्रा अभी भी बन रही थी, और वह मामूली रिसाव इतने सारे स्थानों को लक्षित करने पर घातक क्षति पहुँचाने के लिए पर्याप्त था।
सफलता तब मिली जब शोधकर्ताओं ने स्वयं वितरण वाहन (delivery vehicle) के आकार को बदल दिया। एक गोलाकार डीएनए टुकड़े के बजाय जो कोशिका के भीतर कई बार गुणा होता है, उन्होंने एक ऐसे टुकड़े का उपयोग किया जो एक एकल, स्थिर प्रति (copy) के रूप में रहता है। काटने वाले उपकरण की प्रतियों की संख्या को कई से घटाकर केवल एक करने से, उन्होंने कैंची की कुल मात्रा को काफी कम कर दिया। यह सरल परिवर्तन सफलता की कुंजी था। जब उन्होंने इस लो-कॉपी (low-copy) संस्करण का उपयोग किया, तो यीस्ट कोशिकाएं जीवित रहीं। वे सफलतापूर्वक नए आनुवंशिक पदार्थ को अपने जीनोम के दोहराव वाले खंडों में एकीकृत करने में सफल रहे।
नए जीन प्रभावी रूप से स्थापित हुए हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए, शोधकर्ताओं ने आनुवंशिक पैकेज में एक चमकने वाला मार्कर जोड़ा। जब यीस्ट कोशिकाओं ने सफलतापूर्वक नया डीएनए शामिल किया, तो वे लाल रोशनी के साथ चमकने लगे। एक सूक्ष्मदर्शी के नीचे, टीम ने देखा कि यीस्ट की कुछ कॉलोनियां चमकीली और सुसंगत रूप से चमक रही थीं, जिससे यह सिद्ध हुआ कि नए जीन न केवल मौजूद थे बल्कि कोशिका विभाजन के दौरान स्थिर भी थे। हालाँकि हर कॉलोनी के हर एक कोशिका में चमक नहीं थी, लेकिन इन स्वस्थ, चमकती कॉलोनियों की उपस्थिति ने दिखाया कि विधि काम कर रही है। अध्ययन ने प्रदर्शित किया कि जीनोम में कई स्थानों को एक साथ संपादित करने के लिए, आपको संपादन उपकरण की शक्ति को सावधानीपूर्वक संतुलित करना चाहिए। उपकरण की मात्रा को कम रखकर और यह नियंत्रित करके कि वह कब सक्रिय है, वैज्ञानिक अब यीस्ट पर जटिल आनुवंशिक अपग्रेड कर सकते हैं, जिससे उन कोशिकाओं को नष्ट करने के बजाय जिन्हें वे सुधारने की कोशिश कर रहे हैं, उन्हें बेहतर बनाया जा सके। यह दृष्टिकोण औद्योगिक उपयोग के लिए अधिक मजबूत और उत्पादक यीस्ट स्ट्रेन बनाने के द्वार खोलता है, जिससे एक पहले से घातक प्रक्रिया को एक प्रबंधनीय और सटीक इंजीनियरिंग तकनीक में बदल दिया गया है।
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