CRISPR/Cas9-mediated multicopy δ-site integration in Saccharomyces cerevisiae via Cas9 expression
本研究は、DNA損傷と毒性を軽減するために誘導型Cas9発現とプラスミドコピー数の低減を利用した最適化されたCRISPR/Cas9戦略を提示するものであり、これにより、*Saccharomyces cerevisiae*ゲノムのδサイトへの異種遺伝子の効率的なマルチコピー統合を可能にしている。
原論文は CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) でライセンスされています。 これは査読を受けていないプレプリントのAI生成解説です。医学的助言ではありません。この内容に基づいて健康上の判断をしないでください。 免責事項の全文を読む
単細胞の微小な生物が、単なる生命体であるだけでなく、微視的な工場でもある世界を想像してみてください。科学者たちは、医薬品からバイオ燃料に至るまで、有用な物質を生産するためにこれらの酵母細胞をプログラミングする方法を古くから知っています。これらの工場を効率的にするために、研究者たちはしばしば、酵母のDNAの中に新しい遺伝的指示を挿入する必要があります。課題は、それらの指示を大量に定着させることです。酵母の遺伝暗号には、ゲノム全体に散らばっている長い反復配列という自然な特徴があります。これらの反復配列は、新しい遺伝物質を挿入できる複数の「開いたドア」として機能します。もし科学者がこれらすべてのドアを一度に開けることができれば、細胞に多くのコピーの有用な遺伝子を詰め込み、酵母を高容量の生産者に変えることができます。
しかし、一度に多くのドアを開けすぎると危険です。これらの遺伝的なドアを切り開くために使われるツールは、CRISPR/Cas9と呼ばれる分子のハサミです。科学者たちがこのツールを使って、これらすべての反復するドアを同時に切り開こうとしたとき、酵母細胞は死滅しました。切り込みが多すぎたため、細胞の修復能力が追いつかず、ダメージを与えすぎてしまったのです。これは、一度に多くのことをやりすぎようとした典型的な失敗例でした。問題は、この強力なツールを使用して、細胞を死滅させることなく、いかにして多くのコピーの遺伝子を作るかということでした。
研究チームは、酵母への分子ハサミの届け方を改良することで、この問題を解決しようと試みました。彼らはまず、標準的なアプローチから始めました。ハサミのための指示と、どこを切るかを教えるガイドを、酵母が運ぶことができる小さな環状のDNAに詰め込みました。このDNA断片は、細胞内で何度も複製されるように設計されており、これにより、細胞内に大量の切断ツールが確保される仕組みでした。このセットアップを、挿入したい新しい遺伝的材料とともに酵母に導入しましたが、結果は完全な失敗でした。大量のハサミによって生じた切り込みの量が、細胞にとってあまりにも過酷であり、生存した酵母細胞は一つもありませんでした。大量のハサミによる切り込みが、細胞の遺伝暗号に致命的な損傷を与えたのです。
研究者たちは、問題が「切断の強度」にあることに気づきました。彼らは最初の調整として、酵母に常にハサミを作らせるのではなく、生産をオン・オフできるシステムへと切り替えました。ハサミの製造指示を設計し、酵母にガラクトースという特定の糖を与えたときだけハサミが作られ、グルコースを与えている間は休止状態になるようにしました。その狙いは、まず酵母を強く成長させ、新しい遺伝的材料を挿入する準備が整ったときにのみ切断をトリガーすることでした。しかし、このスイッチを用いても、酵母は依然として死滅しました。原因は、「オフ」の状態が十分に厳密ではなかったことにありました。微量の、バックグラウンドでのハサミの生成が続いており、そのわずかな「漏れ」が、これほど多くの部位を標的にした際に致命的なダメージを引き起こすのに十分だったのです。
突破口は、研究者がデリバリー車両（運び手）自体のサイズを変更したときに訪れました。細胞内で何度も増殖する環状のDNAを使う代わりに、単一の安定したコピーとして留まるものへと切り替えたのです。切断ツールのコピー数を多くからわずか1つへと減らすことで、生成されるハサミの総量を劇的に抑えることに成功しました。この単純な変更こそが、成功の鍵でした。この低コピー版を使用したとき、酵母細胞は生存しました。彼らは、ゲノムの反復セクションへと新しい遺伝的材料を正常に組み込むことができたのです。
新しい遺伝子が定着したことを確認するために、研究者たちは遺伝パッケージに光るマーカーを追加しました。酵母が新しいDNAを正常に組み込むと、赤色の光を放ち始めました。顕微鏡の下で、チームはいくつかの酵母コロニーが明るく一貫して光っているのを確認しました。これは、新しい遺伝子が単に存在するだけでなく、細胞が分裂しても安定していることを証明していました。すべてのコロニーのすべての細胞が光っていたわけではありませんが、健康で光り輝くコロニーの存在は、この手法が機能したことを示していました。この研究は、ゲノムの複数の場所を同時に編集するには、編集ツールのパワーを慎重にバランスさせる必要があることを実証しました。ツールの量を低く保ち、それがいつ活性化するかを正確に制御することで、科学者は今や、細胞を破壊することなく、酵母に対して複雑な遺伝的アップグレードを行うことができます。このアプローチは、以前は致死的であったプロセスを、管理可能で精密なエンジニアリング技術へと変え、より堅牢で生産性の高い酵母株を作成するための道を開くものです。
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