CRISPR/Cas9-mediated multicopy δ-site integration in Saccharomyces cerevisiae via Cas9 expression
本研究提出了一种优化的 CRISPR/Cas9 策略，通过利用诱导型 Cas9 表达和降低质粒拷贝数来减轻 DNA 损伤和毒性，从而实现异源基因高效地整合至酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）基因组的 δ 位点。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
想象一个微小的单细胞生物不仅是生命体，也是微型工厂的世界。科学家们早已知道如何通过编程，让这些酵母细胞生产有用的物质，从药物到生物燃料。为了让这些工厂变得高效，研究人员通常需要将新的遗传指令插入到酵母的 DNA 中。挑战在于如何让这些指令大量地“粘附”上去。酵母细胞在其基因组中有一个天然特征：散布着长长的重复序列。这些重复序列就像是多个开放的门，可以插入新的遗传物质。如果科学家能同时打开所有这些门，他们就能在细胞内填充许多份有用的基因，从而将酵母变成高产量的生产者。
然而，一次性打开太多门是危险的。用于切开这些遗传之门的工具是一种被称为 CRISPR/Cas9 的分子剪刀。当科学家尝试使用这个工具同时切开所有重复的门时，酵母细胞死亡了。切口太多，超出了细胞修复损伤的能力。这是一个典型的试图做得太多、太快的案例。问题变成了：我们如何在不杀死这个过程中的“工厂”的前提下，利用这个强大的工具来制造许多个基因副本呢？
一个研究小组致力于通过改进向酵母传递分子剪刀的方式来解决这个问题。他们首先尝试了一种标准方法，将剪刀的指令和告诉它们在哪里切割的引导序列封装在一个微小的环状 DNA 片段上，以便酵母可以携带。这段 DNA 被设计为可以在细胞内多次复制，以确保有大量的切割工具可用。当他们将这套装置与想要插入的新遗传物质一起引入酵序时，结果完全失败了。没有活着的酵母细胞能在这一过程中存活。由大量剪刀造成的切口数量实在太多，细胞无法承受，导致其遗传密码遭受致命损伤。
研究人员意识到问题在于切割的强度。他们尝试了第一次调整：不再让酵母持续产生剪刀，而是切换到一个可以开启和关闭的系统。他们设计了指令，使剪刀只有在喂食一种名为半乳糖的特定糖类时才会产生，而在喂食葡萄糖时保持休眠。其想法是先让酵母长壮实，然后在准备插入新遗传物质时再触发切割。然而，即使有了这个开关，酵母仍然死亡了。事实证明，“关闭”开关不够严密；仍有少量的剪刀在后台产生，而这种微小的“泄漏”在同时针对这么多位点时，足以造成致命损伤。
突破来自于研究人员改变了递送载体本身的大小。他们没有使用会在细胞内多次复制的环状 DNA 片段，而是换成了一个保持为单个稳定拷贝的片段。通过将切割工具的拷贝数从许多减少到仅有一个，他们极大地降低了剪刀的总产量。这个简单的改变成为了成功的关键。当他们使用这个低拷贝版本时，酵母细胞存活了下来。他们成功地将新的遗传物质整合到了基因组的重复部分中。
为了确认新基因已经稳固扎根，研究人员在遗传包中加入了一个发光的标记。当酵母细胞成功整合了新 DNA 时，它们开始发出红光。在显微镜下，团队看到一些酵母菌落发出明亮且持续的红光，这证明了新基因不仅存在，而且在细胞分裂过程中保持稳定。虽然并非每个菌落中的每一个细胞都在发光，但这些健康且发光的菌落的存在表明该方法奏效了。这项研究表明，要同时编辑基因组中的多个位置，必须仔细平衡编辑工具的力量。通过保持工具的数量处于较低水平并精确控制其活跃时间，科学家现在可以对酵母进行复杂的遗传升级，而不至于破坏他们试图改良的细胞本身。这种方法为创造更强大、更高效的工业用酵母菌株打开了大门，将一个曾经致命的过程转变为一种可控且精准的工程技术。
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