Ancestors of Arylmalonate Decarboxylase show increased Activity, Stability and Stereoselectivity
Durch den Einsatz der Rekonstruktion ancestraler Sequenzen entwickelten Forscher Ahnen der Arylmalonat-Decarboxylase, die im Vergleich zum heute existierenden Enzym eine signifikant erhöhte thermische Stabilität, katalytische Aktivität und Stereoselektivität aufweisen und dadurch entscheidende Einschränkungen bei der Produktion chiraler Carbonsäuren überwinden.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
In der mikroskopischen Welt der Biologie beruht das Leben auf winzigen molekularen Maschinen, den Enzymen, die chemische Reaktionen beschleunigen, die andernfalls ewig dauern würden. Diese Proteine sind die Arbeitspferde der Natur und bauen alles auf, von der DNA in unseren Zellen bis hin zu den Medikamenten, die wir einnehmen. Wenn Wissenschaftler jedoch versuchen, diese natürlichen Enzyme in Fabriken zur Herstellung von Arzneimitteln oder Materialien einzusetzen, stoßen sie oft auf ein frustrierendes Problem: Die Enzyme sind zu zerbrechlich. Sie fallen auseinander, wenn die Temperatur leicht steigt oder wenn sie zu lange verwendet werden, was industrielle Prozesse teuer und ineffizient macht. Darüber hinaus sind viele natürliche Enzyme nicht wählerisch genug; sie könnten eine Mischung aus zwei spiegelbildlichen Versionen eines Moleküls erzeugen, während nur eine Version für den Menschen sicher oder wirksam ist. Um dies zu lösen, wenden Forscher eine Methode an, die rückwärts in der Zeit blickt, um vorwärts zu schreiten. Indem sie mithilfe von Computermodellen die genetischen Baupläne alter, längst ausgestorbener Enzyme rekonstruieren, können sie diese „ancestralen“ (ahnenbezogenen) Proteine im Labor testen. Oft sind diese alten Versionen robuster und vielseitiger als ihre modernen Nachfahren und bieten so eine frische Quelle robuster Werkzeuge für die moderne Industrie.
Ein Forschungsteam setzte sich zum Ziel, ein spezifisches Enzym namens Arylmalonat-Decarboxylase, oder AMDase, zu verbessern. Dieses Enzym ist wertvoll, da es eine Kohlendioxidgruppe von bestimmten Molekülen abspalten kann, um chirale Carbonsäuren zu erzeugen, die essenzielle Bausteine für nichtsteroidale Antirheumatika wie Ibuprofen und Naproxen sind. Die natürliche Version dieses Enzyms, die in einem Bakterium namens Bordetella bronchiseptica vorkommt, funktioniert gut im Labor, weist jedoch erhebliche Nachteile für die großtechnische Nutzung auf. Es ist instabil, verliert bei moderaten Temperaturen in nur etwas mehr als einer Stunde die Hälfte seiner Aktivität und hat Schwierigkeiten mit bestimmten Arten von Rohstoffen, insbesondere solchen, die kleine, sperrige Gruppen angehängt haben. Es versagt zudem manchmal dabei, die reinste Form des gewünschten Arzneimittelmoleküls zu erzeugen. Um dieses Problem zu beheben, versuchten die Wissenschaftler nicht, das moderne Enzym Stück für Stück zu modifizieren. Stattdessen erstellten sie einen Stammbaum der Geschichte des Enzyms und nutzten diesen, um vorherzusagen, wie die Vorfahren vor Millionen von Jahren aussah. Sie synthetisierten die Gene für zehn dieser alten Vorfahren und testeten sie, um zu sehen, ob sie über die Haltbarkeit und Präzision verfügten, die der modernen Version fehlte.
Die Ergebnisse waren beeindruckend. Die Forscher fanden heraus, dass mehrere dieser alten Enzyme weit überlegen an die moderne Version waren. Ein besonderer Vorfahre, den das Team N131 nannte, stach als Champion der Stabilität hervor. Während das moderne Enzym bei Erwärmung schnell zerfällt, blieb N131 unter denselben Bedingungen über hunderte von Stunden aktiv. Tatsächlich hielt N131 bei einer Temperatur von 45 Grad Celsius über 380 Stunden durch, während das moderne Enzym nur etwa anderthalb Stunden überlebte. Diese massive Verbesserung der Langlebigkeit bedeutete, dass N131 hunderte Male mehr Produkt erzeugen konnte, bevor es aufgebraucht war. Das Team entdeckte auch, dass N131 schneller bei der Arbeit war und Rohstoffe effizienter in das Endprodukt umwandelte als das moderne Enzym. Als sie die alten Enzyme auf präparativer Skala testeten, um ein volles Gramm des Chemikals zu produzieren, schloss N131 die Aufgabe in nur 31 Minuten ab und übertraf damit die moderne Version deutlich.
Um zu verstehen, warum N131 so viel robuster war, führten die Forscher detaillierte Computersimulationen der Proteinstruktur durch. Sie fanden heraus, dass das alte Enzym eine Beschichtung aus negativ geladenen chemischen Gruppen auf seiner Oberfläche erworere, die der modernen Version fehlte. Diese Gruppen wirkten wie ein Schutzschild, der eine dichte Schicht von Wassermolekülen um das Protein hielt. Diese Hydratationsschale verhinderte, dass das Enzym bei Hitze verklumpte und auseinanderfiel. Es war eine natürliche Lösung für ein Problem, mit dem moderne Ingenieure oft zu kämpfen haben. Über die Stabilität hinaus zeigten die alten Enzyme auch eine verbesserte Präzision. Ein Vorfahre namens N31 erzeugte einen Arzneimittelbaustein mit einer optischen Reinheit von 99,7 Prozent, was bedeutet, dass fast jedes erzeugte Molekül das korrekte Spiegelbild war. Dieses Maß an Reinheit ist für Pharmazeutika entscheidend, da das falsche Spiegelbild unwirksam oder sogar schädlich sein kann.
Die Studie untersuchte auch, ob diese alten Enzyme Rohstoffe verarbeiten konnten, die die moderne Version ablehnte. Das moderne Enzym kann bestimmte Moleküle mit Ethylgruppen nicht verarbeiten, aber der Vorfahre N131 konnte diese vollständig umwandeln. Die Forscher demonstrierten auch, dass sie die Präferenz des Enzyms umkehren konnten, indem sie es dazu brachten, das entgegengesetzte Spiegelbild des Arzneimittelmoleküls zu produzieren, indem sie lediglich zwei spezifische Aminosäuren im aktiven Zentrum austauschten. Diese Flexibilität zeigte, dass die alten Enzyme nicht nur stärkere Versionen des modernen Enzyms waren, sondern auch anpassungsfähiger. Durch die Kombination der natürlichen Evolution der Vergangenheit mit moderner Technik schuf das Team einen Biokatalysator, der schneller, langlebiger und präziser ist. Diese Arbeit legt nahe, dass der Blick in die tiefe Evolutionsgeschichte von Enzymen verborgene Lösungen für die Stabilitäts- und Selektivitätsprobleme aufzeigen kann, die derzeit die Produktion lebensrettender Medikamente einschränken.
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