Deep axonal proteomics of human iPSC-derived neurons by microfluidic separation and DIA-MS

Die Stadt der Zelle: Eine Reise auf der langen, einsamen Straße

Stellen Sie sich eine Stadt vor, in der der Bürgermeister und die Stadtplaner in einem belebten Innenstadtviertel namens „Soma“ leben, aber die wichtigsten Boten der Stadt hunderte Kilometer weit über eine einzige, schmale Autobahn reisen müssen, um Pakete in die Vororte zu liefern. In der Welt der Biologie ist diese Stadt ein Neuron, eine Nervenzelle. Die Innenstadt ist der Zellkörper, in dem sich die DNA-Bibliothek und die Fabrik zur Herstellung neuer Proteine befinden. Die Autobahn ist das Axon, ein langer, dünner Draht, der beim Menschen über einen Meter lang sein kann und das Gehirn mit den Spitzen Ihrer Zehen verbindt.

Lange Zeit konnten Wissenschaftler nur das Innenstadtgebiet untersuchen. Sie konnten den Zellkörper leicht entnehmen und sehen, welche Proteine dort hergestellt wurden. Aber das Axon? Es war, als würde man versuchen, eine bestimmte Meile einer Autobahn zu untersuchen, indem man die gesamte Stadt aus einem Satelliten heraus betrachtet. Das Axon ist so dünn und so weit entfernt, dass es unglaublich schwierig war, nur die „Straße“ zu isolieren, ohne versehentlich auch das „Innenstadtgebiet“ mit einzufangen. Dies war ein großes Problem, denn wir wissen, dass bei Krankheiten wie ALS und hereditärer spastischer Paraplegie das Unheil oft auf dieser langen, einsamen Straße beginnt, nicht im Stadtzentrum. Um zu verstehen, warum die Straße bricht, müssen wir genau sehen, was auf ihr ist, aber bis jetzt fehlten die Werkzeuge, um ein Nahaufnahmenfoto nur von der Autobahn zu machen.

Der Mikro-Tunnel-Raubüberfall und der Super-Schnüffler

In dieser Arbeit geht es um ein Team von Wissenschaftlern, denen es schließlich gelang, einen Raubüberfall zu planen, um eine reine Probe der „Autobahn“ (des Axons) zu stehlen, ohne das „Innenstadtgebiet“ (den Zellkörper) zu berühren. Dies gelang ihnen mit einem cleveren Trick unter Verwendung winziger, maßgeschneiderter Kunststoffchips mit mikroskopischen Tunneln. Sie züchteten menschliche Nervenzellen (aus Stammzellen gewonnen) auf diesen Chips. Die Zellkörper waren zu fett, um durch die winzigen Tunnel zu passen, aber die Axone, die lang und dünn sind, schlängelten sich ihren Weg durch und besiedelten eine separate Kammer auf der anderen Seite. Es war, als würde man eine Stadt bauen, in der die Vororte durch einen Tunnel mit der Innenstadt verbunden sind, der so schmal ist, dass nur die Lieferwagen hindurchpassen können, während die Stadtplaner im Zentrum feststehen bleiben.

Nachdem sie diese isolierten Axone gewonnen hatten, standen sie vor einem zweiten Problem: Es gab fast kein Material zum Untersuchen. Die geernteten Axone waren so klein, dass sie nur etwa 50 Nanogramm Protein enthielten – etwa das Gewicht eines einzelnen Sandkorns. Traditionelle Mikroskope und chemische Scanner benötigen normalerweise einen ganzen Berg an Material, um zu funktionieren. Um dies zu lösen, nutzte das Team eine extrem empfindliche Maschine namens Orbitrap Astral, die wie ein „Super-Schnüffler“ fungiert und in der Lage ist, die winzigsten molekularen Düfte aufzuspüren. Sie kombinierten dies mit einer Technik namens DIA-MS, was wie das Aufnehmen eines Hochgeschwindigkeitsfotos von jedem einzelnen Protein in der Probe gleichzeitig ist, anstatt nur zu raten, nach welchen man suchen soll.

Was sie auf der Straße fanden

Die Ergebnisse waren ein riesiger Erfolg. Durch die Verwendung dieser neuen Kombination aus Mikro-Tunneln und dem Super-Schnüffler gelang es dem Team, etwa 6.000 verschiedene Proteine im axonalen Kompartiment zu identifizieren und zu zählen. Dies ist die tiefste, detaillierteste Karte des menschlichen Axons, die jemals erstellt wurde, und sie verdoppelt damit mehr als das, was Wissenschaftler bisher gesehen haben. Im Zellkörper fanden sie etwa 9.000 Proteine.

Beim Vergleich der beiden Listen stellten sie fest, dass das Axon nicht nur ein passiver Draht ist, sondern eine geschäftige, spezialisierte Fabrik. Sie entdeckten 1.250 Proteine, die spezifisch im Axon angereichert waren. Diese Proteine waren hauptsächlich an der Bewegung von Vesikeln (winzigen Lieferwagen), der Verwaltung des Zytoskeletts (den strukturellen Balken der Straße) und der Handhabung synaptischer Signale (den Ampeln am Ende der Leitung) beteiligt. Im Gegensatz dazu war der Zellkörper voll von Proteinen, die an der DNA-Ablesung und der Herstellung neuer RNA beteiligt sind, was sinnvoll ist, da dort die Baupläne aufbewahrt werden.

Das Team untersuchte auch zwei verschiedene Arten von Neuronen: kortikale Neuronen (aus dem Denkzentrum des Gehirns) und untere Motoneuronen (die mit Muskeln verbunden sind). Sie fanden einen „Kernsatz“ von 417 Proteinen, die in den Axonen beider Neuronentypen angereichert waren. Dies deutet darauf darauf hin, dass jedes Neuron, egal welcher Art, ein Standard-Werkzeugset besitzt, um am Leben zu bleiben und seine Aufgabe zu erfüllen. Sie fanden jedoch auch subtile Unterschiede. Die Axone der unteren Motoneuronen schienen mehr Proteine im Zusammenhang mit Mitochondrien (den Kraftwerken der Zelle) zu haben, während die Axone der kortikalen Neuronen mehr Proteine im Zusammenhang mit Lysosomen (den Recyclingzentren der Zelle) aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass verschiedene Arten von Neuronen möglicherweise unterschiedliche Wartungsstrategien für ihre langen Straßen benötigen.

Warum dies für die Krankheit wichtig ist

Die Wissenschaftler legten dann ihre neue Karte über eine Liste von Genen, die bekannt dafür sind, neurodegenerative Erkrankungen wie ALS und hereditäre spastische Paraplegie zu verursachen. Sie fanden heraus, dass die meisten der krankheitsverursachenden Proteine nicht natürlich im Axon konzentriert waren; sie waren überall zu finden. Dies ist eine entscheidende Erkenntung. Es deutet darauf hin, dass diese Krankheiten nicht dadurch entstehen, dass die schlechten Proteine im Axon versteckt sind; vielmehr passiert die Krankheit deshalb, weil das Axon so empfindlich ist, dass es das Erste ist, was bricht, wenn diese Proteine Fehlfunktionen aufweisen.

Das Paper kommt zu dem Schluss, dass dieser neue Arbeitsablauf ein leistungsstarkes Werkzeug ist. Er ermöglicht es Wissenschaftlern, das Axon zum ersten Mal klar zu sehen, und offenbart, dass das Axon zwar ein gemeinsames „Kern“-Werkzeugset über verschiedene Neuronentypen hinweg teilt, aber auch einzigartige, spezialisierte Bedürfnisse hat. Mit dieser detaillierten Karte können Forscher nun damit beginnen, genau zu verstehen, wie Krankheiten das empfindliche Gleichgewicht des Axons stören, was potenziell zu besseren Wegen zur Behandlung dieser Zustände führen kann, indem man die Straße schützt, bevor die Stadt zusammenbricht.