Deep axonal proteomics of human iPSC-derived neurons by microfluidic separation and DIA-MS

De Stad van de Cel: Een Tour door de Lange, Eenzame Weg

Stel je een stad voor waar de burgemeester en de stadsplanners wonen in een bruisend stadscentrum genaamd de "Soma", maar waar de belangrijkste boodschappers van de stad honderden kilometers over een enkele, smalle snelweg moeten reizen om pakketjes naar de buitenwijken te bezorgen. In de wereld van de biologie is deze stad een neuron, een zenuwcel. Het stadscentrum is het cellichaam, waar de DNA-bibliotheek en de fabriek voor het maken van nieuwe eiwitten zich bevinden. De snelweg is het axon, een lange, dunne draad die in mensen meer dan een meter lang kan zijn en de hersenen verbindt met de uiteinden van je tenen.

Lange tijd konden wetenschappers alleen het stadscentrum bestuderen. Ze konden gemakkelijk het cellichaam opzuigen en zien welke eiwitten daar werden gemaakt. Maar het axon? Dat was alsof je probeerde een specifieke mijl van een snelweg te bestuderen door naar de hele stad te kijken vanuit een satelliet. Het axon is zo dun en zo ver weg dat het ongelooflijk moeilijk was om alleen de "weg" te isoleren zonder per ongeluk ook het "stadscentrum" mee te pakken. Dit was een groot probleem, want we weten dat bij ziekten zoals ALS en erfelijke spastische paraplegie de problemen vaak beginnen op die lange, eenzame weg, en niet in het stadscentrum. Om te begrijpen waarom de weg kapot gaat, moeten we precies zien wat er op de weg ligt, maar tot nu toe ontbraken de instrumenten om een close-up foto van alleen de snelweg te maken.

De Micro-Tunnel Overval en de Super-Snuiver

Dit artikel gaat over een team wetenschappers dat er eindelijk in geslaagd is een overval te plegen om een zuur monster van de "snelweg" (het axon) te stelen zonder het "stadscentrum" (het cellichaam) aan te raken. Ze deden dit met een slim trucje waarbij gebruik werd gemaakt van piepkleine, op maat gemaakte plastic chips met microscopische tunnels. Ze kweekten menselijke zenuwcellen (gemaakt van stamcellen) op deze chips. De cellichamen waren te dik om door de kleine tunnels te passen, maar de axonen, die lang en dun zijn, kronkelden zich door de tunnels en bevolkten een aparte kamer aan de andere kant. Het was alsof je een stad bouwt waar de buitenwijken verbonden zijn met het stadscentrum door een tunnel die zo smal is dat alleen de bezorgwagens erdoorheen kunnen, waardoor de stadsplanners in het centrum gestrand blijven.

Zodra ze deze geïsoleerde axonen hadden, stuitten ze op een tweede probleem: er was bijna geen materiaal om te bestuderen. De axonen die ze hadden geoogst waren zo klein dat ze slechts ongeveer 50 nanogram eiwit bevatten—ongeveer het gewicht van een enkel zandkorreltje. Traditionele microscopen en chemische scanners hebben meestal een hele berg materiaal nodig om te kunnen werken. Om dit op te lossen, gebruikte het team een supergevoelige machine genaamd een Orbitrap Astral, die fungeert als een "super-snuiver" die in staat is om de kleinste moleculaire geuren op te vangen. Ze combineerden dit met een techniek genaamd DIA-MS, wat lijkt op het maken van een hogesnelheidsfoto van elk afzonderlijk eiwit in het monster tegelijk, in plaats van te gokken naar welke men zou zoeken.

Wat Ze op de Weg Vonden

De resultaten waren een groot succes. Door deze nieuwe combinatie van micro-tunnels en de super-snuiver te gebruiken, slaagde het team erin om ongeveer 6.000 verschillende eiwitten in het axonale compartiment te identificeren en te tellen. Dit is de diepste, meest gedetailleerde kaart van het menselijke axon ooit gemaakt, meer dan het dubbele van wat wetenschappers voorheen hadden gezien. In het cellichaam vonden ze ongeveer 9.000 eiwitten.

Toen ze de twee lijsten vergeleken, ontdekten ze dat het axon niet alleen een passieve draad is, maar een drukke, gespecialiseerde fabriek. Ze ontdekten 1.250 eiwitten die specifiek verrijkt waren in het axon. Deze eiwitten waren voornamelijk betrokken bij het bewegen van vesikels (kleine bezorgwagens), het beheren van het cytoskelet (de structurele balken van de weg) en het afhandelen van synaptische signalen (de verkeerslichten aan het einde van de lijn). In contrast hiermee was het cellichaam vol met eiwitten die betrokken zijn bij het lezen van DNA en het maken van nieuw RNA, wat logisch is aangezien daar de blauwdrukken worden bewaard.

Het team keek ook naar twee verschillende soorten neuronen: corticale neuronen (uit het denkcentrum van de hersenen) en onderste motorische neuronen (die verbinding maken met spieren). Ze vonden een "kernset" van 417 eiwitten die verrijkt waren in de axonen van beide typen neuronen. Dit suggereert dat, ongeacht wat voor type neuron je bent, je axon een standaard gereedschapskist heeft om in leven te blijven en zijn werk te doen. Er waren echter ook subtiele verschillen. De axonen van de onderste motorische neuronen leken meer eiwitten te hebben die gerelateerd zijn aan mitochondriën (de energiecentrales van de cel), terwijl de axonen van de corticale neuronen meer eiwitten hadden die gerelateerd zijn aan lysosomen (de recyclingcentra van de cel). Dit suggereert dat verschillende soorten neuronen mogelijk verschillende onderhoudsstrategieën hebben voor hun lange wegen.

Waarom Dit Belangrijk Is voor Ziekte

De wetenschappers namen vervolgens hun nieuwe kaart en legden deze over een lijst van genen die bekend staan als de oorzaak van neurodegeneratieve ziekten zoals ALS en erfelijke spastische paraplegie. Ze ontdekten dat de meeste ziekteveroorzakende eiwitten niet van nature geconcentreerd waren in het axon; ze waren overal te vinden. Dit is een cruciale bevinding. Het suggereert dat deze ziekten niet gebeuren omdat de slechte eiwitten zich in het axon verstoppen; eerder gebeurt de ziekte omdat het axon zo gevoelig is dat wanneer deze eiwitten defect raken, het axon het eerste is dat breekt.

Het artikel concludeert dat deze nieuwe workflow een krachtig hulpmiddel is. Het stelt wetenschappers in staat om het axon voor het eerst duidelijk te zien, waarbij wordt onthuld dat hoewel het axon een gemeenschappelijke "kern"-gereedschapskist deelt met verschillende typen neuronen, het ook unieke, gespecialiseerde behoeften heeft. Door deze gedetailleerde kaart kunnen onderzoekers nu beginnen te begrijpen hoe ziekten het delicate evenwicht van het axon verstoren, wat potentieel kan leiden tot betere manieren om deze aandoeningen te behandelen door de weg te beschermen voordat de stad in elkaar stort.