Automated in situ CryoET Structure Determination with a Self-Configuring Workflow
Dieses Paper stellt ein automatisiertes Framework vor, das den selbstkonfigurierenden Deep-Learning-Detektor Octopi mit dem standardisierten py2rely-Workflow integriert, um eine hochauflösende (3–20 Å) In-situ-Kryo-Elektronentomographie-Strukturbestimmung über diverse biologische Proben hinweg mit minimalem Expertenaufwand zu ermöglichen.
Originalarbeit lizenziert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dies ist eine KI-generierte Erklärung eines Preprints, das nicht peer-reviewed wurde. Dies ist kein medizinischer Rat. Treffen Sie keine Gesundheitsentscheidungen auf Grundlage dieses Inhalts. Vollständigen Haftungsausschluss lesen
In jeder lebenden Zelle operiert eine geschäftige Stadt aus molekularen Maschinen in drei Dimensionen, die Proteine baut, den genetischen Code kopiert und Materialien transportiert. Um zu verstehen, wie das Leben auf seiner fundamentalsten Ebene funktioniert, müssen Wissenschaftler diese Maschinen nicht nur als isolierte Teile sehen, sondern so, wie sie in ihrer natürlichen, dichten Umgebung existieren. Jahrelang haben Forscher eine Technik namens Kryo-Elektronentomographie genutzt, um dreidimensionale Schnappschüsse dieser gefrorenen Zellen zu machen. Diese Methode ermöglicht es ihnen, in die zelluläre Landschaft hineinzublicken, aber die Umwandlung dieser Rohbilder in klare, hochauflösende Strukturen blieb ein schwieriger, manueller Prozess. Es ist, als besäße man eine Bibliothek aus verschwommenen Fotografien, in der jedes Buch ein wenig anders ist; um den Text zu lesen, muss ein menschlicher Experte jedes Buch sorgfältig auswählen, es mit anderen ausrichten und das Bild von Hand schärfen. Dieser Engpass hat begrenzt, wie viele Strukturen Wissenschaftler untersuchen konnten, wodurch ein Großteil der zellulären Welt unerforscht blieb.
Ein Team von Forschern am Chan Zuckerberg Biohub hat nun ein System entwickelt, das diesen gesamten Prozess automatisiert und eine arbeitsintensive Aufgabe in einen selbstkonfigurierenden Arbeitsablauf verwandelt. Sie entwickelten zwei Hauptwerkzeuge, die zusammenarbeiten: eines, um die molekularen Maschinen im komplexen zellulären Rauschen zu finden, und ein anderes, um aus diesen Funden die klaren Strukturen zusammenzusetzen. Das erste Werkzeug mit dem Namen Octopi fungiert als intelligenter Detektor. Anstatt darauf zu vertrauen, dass ein Mensch ihm in jedem neuen Experiment beibringt, wonach er suchen soll, nutzt Octopi eine Methode des Ausprobierens und Irrtums, um seine internen Einstellungen automatisch an die spezifischen Daten anzupassen, die es analysiert. Es lernt, die Form und das Signal eines Zielmoleküls zu erkennen, selbst wenn dieses Molekül von Membranen oder anderem zellulärem Debris umgeben ist. Sobald Octopi die Standorte dieser Moleküle identifiziert hat, übernimmt das zweite Werkzeug namens py2reely. Dieses System sammelt die identifizierten Teile und kombiniert sie mathematisch, wobei es das Bild durch wiederholte Zyklen verfeinert, bis eine scharfe, dreidimensionale Struktur entsteht.
Die Forscher testeten dieses automatisierte System bei siebzehn verschiedenen Aufgaben, die von gereinigten Molekülen in einem Reagenzglas bis hin zu komplexen, intakten Bakterienzellen und menschlichen Zellen reichten. In jedem Fall funktionierte das System, ohne dass ein Mensch die Software für jeden neuen Datensatz neu konfigurieren musste. Als sie es auf einen Standard-Benchmark-Datensatz anwandten, der sechs verschiedene Arten von Molekülen enthielt, fand der automatisierte Detektor die Zielobjekte genauso genau wie die leistungsstärksten, von Menschen entworfenen Modelle eines kürzlich stattgefundenen internationalen Wettbewerbs. Wichtiger noch war, dass die aus diesen automatisierten Funden aufgebauten Strukturen ebenso klar waren. Für einige Zielobjekte erzeugte das System Bilder mit einer Auflösung von 3,0 Ångström, einer Detailtiefe, die scharf genug ist, um einzelne Atome zu sehen. In anderen herausfordernden Fällen, wie etwa Molekülen, die an Zellmembranen befestigt sind, gelang es dem System dennoch, Strukturen mit Auflösungen zwischen 10 und 20 Ångström zu erzeugen, die die Gesamtform und die Schlüsselmerkmale der Komplexe offenlegten.
Eine der bedeutendsten Errungenschaften war die Fähigkeit des Systems, schwierige Umgebungen zu bewältigen, in denen das Signal schwach oder verdeckt ist. In menschlichen Zellen baten die Forscher das System, zwischen Ribosomen, die frei in der Zellflüssigkeit schweben, und solchen, die an die internen Membranen der Zelle gebunden sind, zu unterscheiden. Durch das Training des Detektors mit nur wenigen manuell markierten Beispielen lernte das System, beide Gruppen sowie die Membranen selbst gleichzeitig zu erkennen. Es trennte die beiden Populationen erfolgreich und baute klare Strukturen für jede von ihnen auf, wobei es sogar einen Proteinkomplex aufdeckte, der an der Membran befestigt war und in früheren Studien beobachtet worden war. Ähnlich identifizierte das System in Bakterienzellen große Proteinringe und virusähnliche Partikel im dichten Bakterienzytoplasma unter Verwendung von nur einer Handvoll Trainingsbeispielen. Es generalisierte sogar auf neue, ungesehene Datensätze und arbeitete korrekt auf verschiedenen Arten von Zellpräparaten, ohne dass eine weitere Feinabstimmung erforderlich war.
Die Studie zeigte auch, dass dieser automatisierte Ansatz bisherige Ergebnisse verbessern kann. Als das Team ihren automatisierten Strukturaufbau-Workflow auf Daten aus einem Wettbewerb anwandte, waren die resultierenden Bilder signifikant schärfer als die ursprünglich veröffentlichten. Beispielsweise wurde eine Ribosomenstruktur, die zuvor mit 6,8 Ångström aufgelöst worden war, allein durch die Anwendung der neuen, konsistenten Verarbeitungsschritte auf 3,7 Ångström verbessert. Dies deutet darauf hin, dass die bisherigen Einschränkungen nicht auf die Daten selbst zurückzuführen waren, sondern auf die manuelle, variable Natur der Analyse. Die Forscher fanden heraus, dass das System sogar aus sehr spärlichen Informationen lernen konnte; für ein schwieriges Zielobjekt war ein Modell, das auf nur fünfzig manuell markierten Beispielen trainiert wurde, ausreichend, um eine hochwertige Struktur zu generieren.
Obwohl das System hocheffektiv ist, merkten die Forscher an, dass in einem Bereich weiterhin menschliches Eingreifen erforderlich war. Für einen spezifischen Proteinkomplex, der in synaptischen Vesikeln gefunden wird, benötigte der automatisierte Workflow einen Menschen, der die beste Gruppe von Partikeln manuell auswählte und die Analysemaske anpasste. Diese Ausnahme unterstreicht, dass das System zwar die meisten Szenarien bewältigen kann, die komplexesten membranassoziierten Zielobjekte jedoch noch von Expertenaufsicht profitieren. Dennoch beweist der Gesamterfolg des Projekts, dass ein allgemeiner, automatisierter Pfad von den Rohdaten zur atomaren Struktur nun möglich ist. Durch die Beseitigung der Notwendigkeit einer expertengeleiteten Partikelauswahl und einer kundenspezifischen Workflow-Zusammenstellung öffnet dieser neue Rahmen die Tür zur Untersuchung einer riesigen Anzahl zellulärer Strukturen in einem Maßstab, der zuvor unmöglich war, und ermöglicht es Wissenschaftlern, die molekulare Maschinerie des Lebens mit beispielloser Geschwindigkeit und Konsistenz abzubilden.
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