Automated in situ CryoET Structure Determination with a Self-Configuring Workflow
Questo articolo introduce un framework automatizzato che integra il detector di deep learning auto-configurante Octopi con il workflow standardizzato py2rely per consentire la determinazione strutturale in situ tramite criotomicroscopia elettronica ad alta risoluzione (3–20 Å) su diversi campioni biologici con un intervento esperto minimo.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
All'interno di ogni cellula vivente, una città frenetica di macchine molecolari opera in tre dimensioni, costruendo proteine, copiando il codice genetico e trasportando materiali. Per capire come funziona la vita al suo livello più fondamentale, gli scienziati devono vedere queste macchine non solo come parti isolate, ma così come esistono nel loro ambiente naturale e affollato. Per anni, i ricercatori hanno utilizzato una tecnica chiamata criotomografia elettronica per scattare istantanee tridimensionali di queste cellule congelate. Questo metodo permette loro di scrutare all'interno del paesaggio cellulare, ma trasformare quelle immagini grezze in strutture chiare ad alta risoluzione è rimasto un processo difficile e manuale. È come avere una biblioteca di fotografie sfocate dove ogni libro è leggermente diverso; per leggere il testo, un esperto umano deve scegliere con cura ogni libro, allinearlo con gli altri e mettere a fuoco l'immagine a mano. Questo collo di bottiglia ha limitato il numero di strutture che gli scienziati possono studiare, lasciando gran parte del mondo cellulare inesplorato.
Un team di ricercatori presso il Chan Zuckerberg Biohub ha costruito un sistema che automatizza l'intero processo, trasformando un compito laborioso in un flusso di lavoro auto-configurante. Hanno sviluppato due strumenti principali che lavorano insieme: uno per trovare le macchine molecolari nel complesso rumore cellulare e un altro per assemblare le strutture chiare da tali scoperte. Il primo strumento, chiamato Octopi, funge da rilevatore intelligente. Invece di fare affidamento su un essere umano per insegnargli cosa cercare in ogni nuovo esperimento, Octopi utilizza un metodo di tentativi ed errori per regolare automaticamente le proprie impostazioni interne per adattarsi ai dati specifici che sta analizzando. Impara a riconoscere la forma e il segnale di una molecola bersaglio, anche quando quella molecola è circondata da membrane o altri detriti cellulari. Una volta che Octopi ha identificato la posizione di queste molecole, il secondo strumento, chiamato py2repy, prende il controllo. Questo sistema raccoglie i pezzi identificati e li combina matematicamente, perfezionando l'immagine attraverso cicli ripetuti finché non emerge una struttura tridimensionale nitida.
I ricercatori hanno testato questo sistema automatizzato su diciassette compiti diversi, che vanno da molecole purificate in una provetta a cellule batteriche intatte e complesse e cellule umane. In ogni caso, il sistema ha funzionato senza la necessità che un essere umano riconfigurasse il software per ogni nuovo set di dati. Quando lo hanno applicato a un dataset standard contenente sei tipi diversi di molecole, il rilevatore automatizzato ha trovato i bersagli con la stessa precisione dei modelli progettati da esseri umani che hanno ottenuto le migliori prestazioni in una recente competizione internazionale. Ancora più importante, le strutture costruite da queste scoperte automatizzate erano altrettanto chiare. Per alcuni bersagli, il sistema ha prodotto immagini con una risoluzione di 3,0 Ångström, un livello di dettaglio abbastanza nitido da vedere i singoli atomi. In altri casi più impegnativi, come molecole attaccate alle membrane cellulari, il sistema è riuscito comunque a produrre strutture con risoluzioni comprese tra 10 e 20 Ångström, rivelando la forma generale e le caratteristiche chiave dei complessi.
Uno dei risultati più significativi è stata la capacità del sistema di gestire ambienti difficili in cui il segnale è debole o oscurato. Nelle cellule umane, i ricercatori hanno chiesto al sistema di distinguere tra i ribosomi che fluttuano liberamente nel fluido cellulare e quelli attaccati alle membrane interne della cellula. Addestrando il rilevatore su pochi esempi etichettati manualmente, il sistema ha imparato a riconoscere entrambi i gruppi e le membrane stesse simultaneamente. Ha separato con successo le due popolazioni e ha costruito strutture chiare per ciascuna di esse, rivelando persino un complesso proteico attaccato alla membrana che era stato visto in studi precedenti. Allo stesso modo, nelle cellule batteriche, il sistema ha identificato grandi anelli proteici e particelle simili a virus nel denso citoplasma batterico utilizzando solo una manciata di esempi di addestramento. Si è persino generalizzato a nuovi dataset non visti, funzionando correttamente su diversi tipi di preparazioni cellulari senza alcuna ulteriore calibrazione.
Lo studio ha anche dimostrato che questo approccio automatizzato può migliorare i risultati precedenti. Quando il team ha applicato il loro flusso di lavoro per la costruzione automatizzata delle strutture ai dati di una competizione, le immagini risultanti erano significativamente più nitide di quelle pubblicate originariamente. Ad esempio, una struttura del ribosoma che era stata precedentemente risolta a 6,8 Ångström è stata migliorata a 3,7 Ångström semplicemente utilizzando i nuovi passaggi di elaborazione coerenti. Ciò suggerisce che i limiti precedenti non erano dovuti ai dati stessi, ma alla natura manuale e variabile dell'analisi. I ricercatori hanno scoperto che il sistema poteva persino imparare da informazioni molto scarse; per un bersaglio difficile, un modello addestrato su soli cinquanta esempi marcati manualmente è stato sufficiente per generare una struttura di alta qualità.
Sebbene il sistema sia altamente efficace, i ricercatori hanno notato un'area in cui l'intervento umano era ancora necessario. Per un complesso proteico specifico presente nelle vescicole sinaptiche, il flusso di lavoro automatizzato ha richiesto a un essere umano di selezionare manualmente il miglior gruppo di particelle e regolare la maschera di analisi. Questa eccezione evidenzia che, sebbene il sistema possa gestire la maggior parte degli scenari, i bersagli associati alle membrane più complessi beneficiano ancora della supervisione di un esperto. Tuttavia, il successo complessivo del progetto dimostra che un percorso generale e automatizzato dai dati grezzi alla struttura atomica è ora possibile. Eliminando la necessità di selezione delle particelle guidata dall'esperto e di assemblaggio di flussi di lavoro personalizzati, questo nuovo framework apre la porta allo studio di una vasta gamma di strutture cellulari a una scala precedentemente impossibile, permettendo agli scienziati di mappare il macchinario molecolare della vita con una velocità e una coerenza senza precedenti.
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