A noncanonical PLP-dependent enzyme catalyzes β-serine biosynthesis in the edeine antibiotic pathway
Diese Studie identifiziert und charakterisiert EdeM, ein nicht-kanonisches PLP-abhängiges Enzym, das die beispiellose intramolekulare Umlagerung von L-Serin katalysiert, um enantiomerenreines D--Serin für die Biosynthese des Edein-Antibiotikums zu erzeugen, und erweitert damit das bekannte katalytische Repertoire der PLP-Enzyme.
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Das Leben auf der Erde beruht auf einem Satz von zwanzig Standard-Bausteinen, um die Proteine zu konstruieren, die jeden biologischen Prozess vorantreiben. Dies sind die Alpha-Aminosäuren, bei denen ein zentrales Kohlenstoffatom eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe und eine Seitenkette trägt. Die Natur greift jedoch gelegentlich über diesen Standardsatz hinaus und baut ungewöhnliche Varianten in spezialisierte Moleküle wie Antibiotika ein. Eine solche Variante ist die Beta-Aminosäure, bei der die Aminogruppe am zweiten Kohlenstoff in der Kette statt am ersten sitzt. Diese kleine Verschiebung der Position verändert die Form und Stabilität des Moleküls, was es resistent gegen die Enzyme macht, die normalerweise Proteine abbauen. Während Wissenschaftler schon lange wissen, wie Bakterien einige dieser Beta-Aminosäuren herstellen, blieb die Methode zur Produktion einer spezifischen, nämlich der D-Beta-Serin, ein Rätsel, was eine Lücke in unserem Verständnis darüber hinterließ, wie bestimmte starke Antibiotika zusammengesetzt werden.
Ein Team von Forschern der McMaster University und der Brock University hat dieses Rätsel nun gelöst, indem sie ein spezifisches Enzym namens EdeM identifiziert und charakterisiert haben. Dieses Enzym ist für die Herstellung von D-Beta-Serin im Pfad verantwortlich, der Edein produziert, ein Peptidantibiotikum, das von dem Bodenbakterium Brevibacillus brevis hergestellt wird. Die Entdeckung ist bedeutend, da EdeM eine chemische Transformation durchführt, die in dieser Enzymfamilie noch nie zuvor gesehen wurde. Während die meisten Enzyme dieses Typs dadurch arbeiten, dass sie Teile zwischen zwei verschiedenen Molekülen austauschen, nimmt EdeM ein einzelnes Molekül der gewöhnlichen Aminosäure L-Serin und ordnet dessen interne Struktur neu an, um die Beta-Version zu erzeugen. Es tut dies, ohne ein zweites Molekül zu benötigen, das Teile aufnimmt oder abgibt, und es tut dies mit perfekter Präzision, wobei es nur eine spezifische 3D-Form des Produkts erzeugt.
Die Forscher begannen damit, nach den genetischen Anweisungen für die Herstellung von Edein zu suchen. Sie fanden ein Gen, edeM, das einem Gen für Aminotransferasen sehr ähnlich sah. Diese Standardenzyme wirken typischerweise wie molekulare Scheren und Kleber, die eine Aminogruppe von einem Molekül abschneiden und an ein anderes anheften. Um zu testen, was EdeM tatsächlich tat, produzierte das Team das Enzym im Labor und mischte es mit L-Serin. Sie fanden heraus, dass EdeM die L-Serin ganz allein in D-Beta-Serin umwandelte, ohne andere chemische Partner hinzuzufügen. Dies war unerwartet, da das Standardmodell für diese Enzyme zwei verschiedene Substrate erfordert, damit sie arbeiten können. Weitere Experimente zeigten, dass EdeM extrem wählerisch ist; es arbeitet nur an L-Serin und ignoriert andere ähnliche Aminosäuren.
Um zu verstehen, wie diese Reaktion mit einem einzelnen Substrat abläuft, mussten die Wissenschaftler genau sehen, was sich innerhalb des Enzyms bewegt. Sie züchteten Kristalle von EdeM und nutzten Röntgenstrahlen, um dessen atomare Struktur abzubilden. Das Enzym sah aus wie ein typischer Aminotransferase, aufgebaut aus zwei identischen Hälften, die eine Tasche bilden, in der die Reaktion stattfindet. In dieser Tasche fanden sie ein Helfermolekül namens PLP, das als chemischer Anker für die Aminosäure fungiert. Die Struktur enthüllte, dass das Enzym stark auf vier spezifischen Tyrosinresten basiert, welche Aminosäuren mit Hydroxylgruppen sind, um das Substrat an Ort und Stelle zu halten. Als die Forscher diese Tyrosine mutierten, hörte das Enzym auf zu arbeiten, was bewies, dass sie für diese einzigartige Reaktion essenziell sind.
Das Team nutzte dann eine Reihe geschickter Experimente, um den Weg der Atome während der Reaktion zu verfolgen. Sie verwendeten Wasser, das eine schwere Version von Sauerstoff enthielt, um zu sehen, ob das Enzym das Molekül zerlegt und mit Wasser wieder zusammensetzt – ein häufiger Schritt in vielen chemischen Reaktionen. Die Ergebnisse zeigten keine Einlagerung des schweren Sauerstoffs, was den Standardmechanismus ausschloss, bei dem das Molekül geschnitten und hydrolysiert wird. Sie verwendeten auch mit einem schweren Isotop markiertes Kohlendioxid, um zu sehen, ob das Enzym Kohlendioxid freisetzt und dann ein neues aus der Luft aufnimmt. Das Produkt enthielt nur den ursprünglichen Kohlenstoff aus dem Ausgangsmaterial, was bewies, dass das Kohlendioxid niemals in die Umgebung abgegeben wurde.
Die aufschlussreichsten Hinweise ergaben sich aus der Verfolgung der Bewegung von Kohlenstoffatomen und Wasserstoffatomen. Durch die Verwendung von L-Serin, bei dem die Kohlenstoffatome markiert waren, entdeckten sie, dass das Kohlenstoffatom, das ursprünglich an der zweiten Position in der Kette war, an die dritte Position im Endprodukt wanderte. Gleichzeitig wanderte die Carboxylgruppe, die an das erste Kohlenstoffatom gebunden war, zur neuen dritten Position. Dies bedeutete, dass sich das gesamte Kohlenstoffgerüst des Moleküls neu geordnet hatte. Weitere Tests mit schwerem Wasserstoff zeigten, dass zwei Wasserstoffatome an die neue Position hinzugefügt wurden, was bestätigte, dass die Reaktion eine spezifische Migration der Carboxylgruppe von einem Ende des Moleküls zum anderen beinhaltete.
Um zu erklären, wie diese Migration abläuft, wandten sich die Forscher an Computersimulationen. Sie modellierten die Reaktion innerhalb des aktiven Zentrums des Enzyms und testeten zwei mögliche Wege. Eine Idee beinhaltete, dass das Molekül einen vorübergehenden, stark gespannten dreigliedrigen Ring bildet, ähnlich einem verdrehten Dreieck, bevor es sich wieder öffnet. Obwohl der Computer zeigte, dass diese Form existieren kann, konnte er keinen klaren Weg finden, um dorthin zu gelangen. Das andere Modell beinhaltete ein direktes, sanftes Gleiten der Carboxylgruppe von einem Kohlenstoff zum nächsten, ein Prozess, der als 1,2-Migration bekannt ist. Die Simulationen zeigten, dass dieser direkte Weg eine sehr niedrige Energiebarriere hat, was bedeutet, dass er leicht ablaufen kann, und dass die spezifischen Tyrosinreste im Enzym wie ein Gerüst fungieren, um die beweglichen Teile während der Verschiebung zu stabilisieren. Dieser 1,2-Migrationsmechanismus passt zu allen experimentellen Daten und erklärt, wie das Enzym die Carboxylgruppe bewegt, ohne das Molekül aufzubrechen oder Kohlendioxid freizusetzen.
Diese Entdeckung zeigt einen neuen Weg auf, wie die Natur Aminosäuren manipulieren kann. EdeM erweitert die bekannten Fähigkeiten von PLP-abhängigen Enzymen und zeigt, dass sie komplexe interne Umlagerungen ohne die üblichen Partner oder Schritte durchführen können. Das Enzym produziert D-Beta-Serin mit perfekter stereochemischer Kontrolle und erzeugt so eine einzige, reine Form des Moleküls. Interessanterweise enthält das fertige Edein-Antibiotikum die L-Form von Beta-Serin, was darauf hindeutet, dass ein anderes Enzym die Form des Moleküls nach der Herstellung durch EdeM drehen muss – ein Schritt, der noch entdeckt werden muss. Indem sie diesen einzigartigen enzymatischen Weg definieren, liefert die Studie einen Bauplan dafür, wie Bakterien komplexe Antibiotika aufbauen, und bietet ein neues Werkzeug für Wissenschaftler, die ähnliche Moleküle für medizinische Zwecke erschaffen wollen. Die Arbeit unterstreicht die unglaubliche Vielseitigkeit biologischer Katalysatoren, die in der Lage sind, chemische Leistungen zu vollbringen, die zuvor als unmöglich galten.
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