A noncanonical PLP-dependent enzyme catalyzes β-serine biosynthesis in the edeine antibiotic pathway

Het leven op aarde is afhankelijk van een set van twintig standaard bouwstenen om de eiwitten te construeren die elk biologisch proces aansturen. Dit zijn de alfa-aminozuren, waarbij een centraal koolstofatoom een aminogroep, een carboxylgroep en een zijketen vasthoudt. De natuur reikt echter af en toe verder dan deze standaardset door ongewone varianten in te voegen in gespecialiseerde moleculen zoals antibiotica. Een dergelijke variant is het bèta-aminozuur, waarbij de aminogroep aan het tweede koolstofatoom in de keten is bevestigd in plaats van aan het eerste. Deze kleine verschuiving in positie verandert de vorm en stabiliteit van het molecuul, waardoor het resistent wordt tegen de enzymen die normaal gesproken eiwitten afbreken. Hoewel wetenschappers al lang weten hoe bacteriën sommige van deze bèta-aminozuren creëren, bleef de methode die wordt gebruikt om een specifieke variant genaamd D-bèta-serine te produceren een mysterie, wat een gat liet in ons begrip van hoe bepaalde krachtige antibiotica worden samengesteld.

Een team onderzoekers van McMaster University en Brock University heeft dit puzzelstukje nu opgelost door een specifiek enzym genaamd EdeM te identificeren en te karakteriseren. Dit enzym is verantwoordelijk voor het creëren van D-bèta-serine in het pad dat de productie levert van het peptide-antibioticum edeine, gemaakt door een bodembacterie genaamd Brevibacillus brevis. De ontdekking is significant omdat EdeM een chemische transformatie uitvoert die nog nooit eerder in deze familie van enzymen is gezien. Terwijl de meeste enzymen van dit type werken door onderdelen tussen twee verschillende moleculen uit te wisselen, neemt EdeM een enkel molecuul van het algemene aminozuur L-serine en herstructureert de interne structuur ervan om de bèta-versie te creëren. Het doet dit zonder een tweede molecuul nodig te hebben om onderdelen te accepteren of te doneren, en het doet dit met perfecte precisie, waarbij het slechts één specifieke 3D-vorm van het product produceert.

De onderzoekers begonnen door te kijken naar de genetische instructies voor het maken van edeine. Ze vonden een gen, edeM, dat erg leek op genen voor enzymen die bekend staan als aminotransferasen. Deze standaard enzymen werken doorgaans als moleculaire scharen en lijm, waarbij ze een aminogroep van het ene molecuul afknippen en aan het andere molecuul bevestigen. Om te testen wat EdeM daadwerkelijk deed, produceerde het team het enzym in het laboratorium en mengde het met L-serine. Ze ontdekten dat EdeM de L-serine in zijn eentje in D-bèta-serine omzette, zonder andere chemische partners toe te voegen. Dit was onverwacht, aangezien het standaardmodel voor deze enzymen vereist dat er twee verschillende substraten zijn om te kunnen werken. Verdere experimenten toonden aan dat EdeM extreem kieskeurig is; het werkt alleen op L-serine en negeert andere vergelijkbare aminozuren.

Om te begrijpen hoe deze reactie met een enkel substraat plaatsvindt, moesten de wetenschappers precies zien wat er binnen het enzym bewoog. Ze kweekten kristallen van EdeM en gebruikten röntgenstraling om de atomaire structuur in kaart te brengen. Het enzym zag eruit als een typisch aminotransferase, opgebouwd uit twee identieke helften die een zak vormen waar de reactie plaatsvindt. Binnen deze zak vonden ze een helpermolecuul genaamd PLP, dat fungeert als een chemisch anker voor het aminozuur. De structuur onthulde dat het enzym sterk leunt op vier specifieke tyrosineresiduen, wat aminozuren zijn met hydroxylgroepen, om het substraat op zijn plaats te houden. Wanneer de onderzoekers deze tyrosines muteerden, stopte het enzym met werken, wat bewees dat ze essentieel zijn voor deze unieke reactie.

Het team gebruikte vervolgens een reeks slimme experimenten om het pad van de atomen te volgen terwijl de reactie plaatsvond. Ze gebruikten water met een zware versie van zuurstof om te zien of het enzym het molecuul uit elkaar brak en het met water weer assembleerde, een veelvoorkomende stap in veel chemische reacties. De resultaten toonden aan dat er geen incorporatie van de zware zuurstof plaatsvond, wat de standaardmethode uitsluit waarbij het molecuul wordt afgebroken en gehydrolyseerd. Ze gebruikten ook koolstofdioxide gelabeld met een zwaar isotoop om te zien of het enzym koolstofdioxide vrijgaf en vervolgens een nieuwe uit de lucht greep. Het product bevatte alleen de oorspronkelijke koolstof van het startmateriaal, wat bewees dat de koolstofdioxide nooit in de omringende oplossing werd vrijgegeven.

De meest onthullende aanwijzingen kwamen voort uit het volgen van de beweging van koolstofatomen en waterstofatomen. Door L-serine te gebruiken waarbij de koolstofatomen waren gelabeld, ontdekten ze dat het koolstofatoom dat oorspronkelijk op de tweede positie in de keten zat, naar de derde positie in het eindproduct bewoog. Tegelijkertijd bewoog de carboxylgroep, die aan het eerste koolstofatoom was bevestigd, naar de nieuwe derde positie. Dit betekende dat het gehele koolstofskelet van het molecuul zichzelf had geherstructureerd. Verdere tests met zwaar waterstof toonden aan dat er twee waterstofatomen werden toegevoegd aan de nieuwe positie, wat bevestigde dat de reactie een specifieke migratie van de carboxylgroep van het ene uiteinde van het molecuul naar het andere omvatte.

Om uit te leggen hoe deze migratie plaatsvindt, gebruikten de onderzoekers computersimulaties. Ze modelleerden de reactie binnen de actieve site van het enzym en testten twee mogelijke paden. Eén idee hield in dat het molecuul een tijdelijke, zeer gespannen drieledige ring vormde, vergelijkbaar met een gedraaide driehoek, voordat het weer openging. Hoewel de computer liet zien dat deze vorm kon bestaan, kon hij geen duidelijk pad vinden om daar te komen. Het andere model betrof een directe, vloeiende glijbeweging van de carboxylgroep van het ene koolstofatoom naar het volgende, een proces dat bekend staat als een 1,2-migratie. De simulaties toonden aan dat dit directe pad een zeer lage energiebarrière had, wat betekent dat het gemakkelijk kon gebeuren, en dat de specifieke tyrosineresiduen in het enzym fungeerden als een steiger om de bewegende delen tijdens de verschuiving te stabiliseren. Dit 1,2-migratiemechanisme komt overeen met alle experimentele gegevens en verklaart hoe het enzym de carboxylgroep verplaatst zonder het molecuul uit elkaar te breken of koolstofdioxide vrij te geven.

Deze ontdekking onthult een nieuwe manier waarop de natuur aminozuren kan manipuleren. EdeM breidt de bekende mogelijkheden van PLP-afhankelijke enzymen uit, door aan te tonen dat ze complexe interne herschikkingen kunnen uitvoeren zonder de gebruikelijke partners of stappen. Het enzym produceert D-bèta-serine met perfecte stereochemische controle, waarbij het één enkele, pure vorm van het molecuul creëert. Interessant genoeg bevat het uiteindelijke edeine-antibioticum de L-vorm van bèta-serine, wat suggereert dat een ander enzym de vorm van het molecuul moet omdraaien nadat EdeM het heeft gemaakt, een stap die nog ontdekt moet worden. Door dit unieke enzymatische traject te definiëren, biedt de studie een blauwdruk voor hoe bacteriën complexe antibiotica opbouwen en biedt het een nieuw instrument voor wetenschappers die dergelijke moleculen voor medisch gebruik willen creëren. Het werk benadrukt de ongelooflijke veelzijdigheid van biologische katalysatoren, die kunnen evolueren om chemische prestaties te leveren die voorheen als onmogelijk werden beschouwd.