Adult porcine intestinal organoids as models for regional epithelial identity and individual regulatory variation

Problema
Comprender cómo la variación genética moldea las vías celulares que subyacen a los rasgos complejos en los animales de granja sigue siendo un desafío central. Aunque los modelos predictivos avanzados y los enfoques multiómicos pueden nominar variantes candidatas y mecanismos reguladores a gran escala, la validación causal sigue siendo un cuello de botella. Los modelos in vitro avanzados, específicamente los organoides, se consideran cada vez más una interfaz experimental necesaria entre la predicción genómica y los fenotipos animales. Sin embargo, para que estos modelos sean efectivos en la investigación de la relación genotipo-fenotipo, es esencial determinar si conservan dos características críticas: (1) la identidad epitelial específica de segmento del intestino nativo (identidad regional) y (2) las firmas moleculares específicas del animal que reflejan la variación genética o regulatoria. Estudios previos han establecido los organoides intestinales porcinos como modelos epiteliales robustos, pero no se había explorado plenamente hasta ahora el grado en que los organoides derivados de múltiples segmentos intestinales adultos conservan tanto los programas transcripcionales regionales como las firmas regulatorias específicas de cada animal dentro de un único diseño experimental.

Metodología
El estudio utilizó cuatro cerdos de raza Large White de edad de sacrificio. Se recolectaron muestras intestinales de cuatro segmentos distintos: duodeno, yeyuno, íleon y colon. Para cada segmento, se preservó una muestra de tejido nativo para la extracción de ARN, y una muestra emparejada se utilizó para establecer organoides intestinales 3D. Estos organoides fueron generados, criopreservados en el pasaje 2 y expandidos utilizando un protocolo estandarizado.

Se generaron un total de 32 bibliotecas de RNA-seq a partir de tejidos y organoides emparejados. El estudio empleó un flujo de trabajo de análisis transcriptómico exhaustivo:

• Procesamiento de datos: Las lecturas se alinearon con el genoma de referencia porcino (Sscrofa11.1) utilizando el pipeline TAGADA.
• Evaluación de identidad: Se utilizaron el escalamiento multidimensional (MDS) y el Análisis de Componentes Principales (PCA) para comparar los organoides con los tejidos nativos y conjuntos de datos públicos (incluyendo hígado, músculo y etapas de desarrollo desde fetal hasta recién nacido).
• Conjuntos de genes: Los análisis se estratificaron por todos los genes expresados, genes de firma de células epiteliales (derivados de RNA-seq de célula única) y genes de inmunidad innata.
• Expresión diferencial: Se realizaron particiones de varianza y análisis de expresión diferencial (usando limma-voom) para evaluar la variación atribuible al segmento intestinal y al animal individual.
• Enriquecimiento funcional: Se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) para identificar procesos biológicos compartidos.
• Análisis de variantes: Se analizaron datos de secuenciación de genoma completo para loci específicos (FUT2 y B4GALNT2) con el fin de investigar variantes cis-regulatorias candidatas asociadas con las diferencias de expresión observadas.

Contribuciones clave y resultados
El estudio proporciona una caracterización transcriptómica de los organoides intestinales porcinos adultos en comparación con sus tejidos nativos:

1. Identidad transcripcional y estructura regional: Los organoides fueron transcriptómicamente distintos de los tejidos nativos, pero permanecieron dentro del espacio transcripcional intestinal. Mientras que los tejidos nativos se agruparon distintamente por segmento intestinal, los organoides mostraron una separación clara entre las muestras de intestino delgado y colon, con una discriminación parcial entre las regiones del intestino delgado. Esta estructura regional se preservó particularmente al analizar los genes de firma de células epiteliales (81.8% de similitud con los tejidos).
2. Solapamiento de genes: Una proporción elevada de genes fue compartida entre los tejidos y los organoides (81.2% de todos los genes detectados). Sin embargo, los genes de la inmunidad innata mostraron un menor grado de organización regional en los organoides en comparación con los tejidos nativos, con un 19.0% de los genes de inmunidad innata siendo específicos de cada tejido.
3. Estado de desarrollo: La proyección de los organoides del íleon sobre una referencia de desarrollo in vivo (que abarca desde la etapa fetal hasta la de recién nacido) los posicionó más cerca de las muestras fetales o de recién nacido que del íleon de la edad de sacrificio. Esto sugiere un estado transcripcional inmaduro en los organoides, detectable incluso dentro de los subconjuntos de genes epiteliales e inmunes innatos.
4. Programas funcionales regionales: Aunque el número de genes diferencialmente expresados (DEG) entre segmentos fue significativamente menor en los organoides que en los tejidos, un subconjunto de marcadores regionales funcionalmente informativos se conservó de manera consistente. Los DEG compartidos incluyeron marcadores para el desarrollo intestinal, absorción, metabolismo y respuestas inmunitarias mucosas.
5. Firmas específicas del animal: Los organoides retuvieron firmas de expresión específicas de ciertos animales. Notablemente, los genes relacionados con la glicosilación FUT2 y B4GALNT2 mostraron patrones específicos de animal muy fuertes que se preservaron in vitro.
   • FUT2: La expresión se redujo drásticamente en un animal (A4) tanto en tejidos como en organoides. Esto se correlacionó con variantes intrónicas vinculadas (una inserción de trinucleótido CGG y un SNP) que segregan con el fenotipo de expresión.
   • B4GALNT2: La expresión separó a dos pares de animales (A1/A2 vs. A3/A4) y segregó con variantes candidatas que afectan la expresión de proteínas o el procesamiento de los transcritos.

Significancia
El artículo concluye que los organoides intestinales porcinos adultos retienen un componente epitelial sustancial de la identidad regional y preservan selectas firmas regulatorias específicas de cada animal, a pesar de mostrar una reducción en el patrón espacial para los genes de la inmunidad innata y retener características de inmadurez transcripcional.

Los autores sostienen que estos hallazgos respaldan el uso de biobancos de organoides estandarizados, provenientes de cerdos genotipados y fenotipados, como sistemas controlados para el seguimiento funcional de genes, variantes y vías candidatas, particularmente cuando el mecanismo biológico de interés se centra en el epitelio intestinal. El estudio destaca que, si bien los organoides estándar son adecuados para preguntas centradas en el epitelio, presentan límites en cuanto al intercambio entre el sistema inmune y el epitelio y los estados de maduración, lo que requiere una correspondencia entre la complejidad del modelo y la pregunta biológica específica. La preservación de firmas específicas de animales como FUT2 y B4GALNT2 proporciona una prueba de concepto de que estos modelos pueden revelar la variación regulatoria relevante para la genética de animales de granja.