Adult porcine intestinal organoids as models for regional epithelial identity and individual regulatory variation

Problema
Compreender como a variação genética molda as vias celulares subjacentes a características complexas em animais de produção continua sendo um desafio central. Embora modelos preditivos avançados e abordagens multiômicas possam nomear variantes candidatas e mecanismos regulatórios em escala, a validação causal permanece um gargalo. Modelos in vitro avançados, especificamente organoides, são cada vez mais vistos como uma interface experimental necessária entre a predição genômica e os fenótipos animais. No entanto, para que esses modelos sejam eficazes na pesquisa de genótipo-para-fenótipo, é essencial determinar se eles retêm duas características críticas: (1) a identidade epitelial segmentar específica do intestino nativo (identidade regional) e (2) assinaturas moleculares específicas do animal que refletem a variação genética ou regulatória. Estudos anteriores estabeleceram os organoides intestinais suínos como modelos epiteliais robustos, mas a extensão em que organoides derivados de múltiplos segmentos intestinais retêm tanto os programas transcricionais regionais quanto as assinaturas regulatórias específicas de cada animal dentro de um único delineamento experimental ainda não havia sido totalmente explorada.

Metodologia
O estudo utilizou quatro porcos da raça Large White em idade de abate. Amostras intestinais foram coletadas de quatro segmentos distintos: duodeno, jejuno, íleo e cólon. Para cada segmento, uma amostra de tecido nativo foi preservada para extração de RNA, e uma amostra correspondente foi utilizada para estabelecer organoides intestinais 3D. Esses organoides foram gerados, criopreservados na passagem 2 e expandidos utilizando um protocolo padronizado.

Um total de 32 bibliotecas de RNA-seq foram geradas a partir de tecidos e organoides correspondentes. O estudo empregou um fluxo de trabalho de análise transcriptômica abrangente:

• Processamento de Dados: As leituras foram alinhadas ao genoma de referência suíno (Sscrofa11.1) usando o pipeline TAGADA.
• Avaliação de Identidade: Escalonamento multidimensional (MDS) e Análise de Componentes Principais (PCA) foram usados para comparar organoides com tecidos nativos e conjuntos de dados públicos (incluindo fígado, músculo e estágios de desenvolvimento de feto a recém-nascido).
• Conjuntos de Genes: As análises foram estratificadas por todos os genes expressos, genes de assinatura de células epiteliais (derivados de RNA-seq de célula única) e genes de imunidade inata.
• Expressão Diferencial: Particionamento de variância e análises de expressão diferencial (usando limma-voom) foram conduzidos para avaliar a variação atribuível ao segmento intestinal e ao animal individual.
• Enriquecimento Funcional: Análises de enriquecimento de Gene Ontology (GO) foram realizadas para identificar processos biológicos compartilhados.
• Análise de Variantes: Dados de sequenciamento de genoma completo foram analisados para loci específicos (FUT2 e B4GALNT2) para investigar variantes cis-regulatórias candidatas associadas às diferenças de expressão observadas.

Principais Contribuições e Resultados
O estudo fornece uma caracterização transcriptômica de organoides intestinais suínos adultos em comparação com seus tecidos nativos:

1. Identidade Transcricional e Estrutura Regional: Os organoides foram transcriptomicamente distintos dos tecidos nativos, mas permaneceram dentro do espaço transcricional intestinal. Embora os tecidos nativos tenham se agrupado distintamente por segmento intestinal, os organoides mostraram uma separação clara entre amostras do intestino delgado e do cólon, com discriminação parcial entre as regiões do intestino delgado. Essa estrutura regional foi particularmente preservada quando analisados os genes de assinatura de células epiteliais (81,8% de compartilhamento com os tecidos).
2. Sobreposição de Genes: Uma alta proporção de genes foi compartilhada entre tecidos e organoides (81,2% de todos os genes detectados). No entanto, os genes de imunidade inata mostraram um grau menor de organização regional nos organoides em comparação aos tecidos nativos, com 19,0% dos genes de imunidade inata sendo específicos do tecido.
3. Estado de Desenvolvimento: A projeção de organoides do íleo em uma referência de desenvolvimento in vivo (abrangendo de feto a recém-nascido) posicionou-os mais próximos de amostras fetais ou de recém-nascidos do que do íleo de idade de abate. Isso sugere um estado transcricional imaturo nos organoides, detectável mesmo dentro dos subconjuntos de genes epiteliais e de imunidade inata.
4. Programas Funcionais Regionais: Embora o número de genes diferencialmente expressos (DEGs) entre os segmentos tenha sido significamente menor nos organoides do que nos tecidos, um subconjunto de marcadores regionais funcionalmente informativos foi consistentemente preservado. Os DEGs compartilhados incluíram marcadores para desenvolvimento intestinal, absorção, metabolismo e respostas imunes mucosas.
5. Assinaturas Específicas de Animais: Os organoides retiveram assinaturas de expressão específicas de animais selecionadas. Notavelmente, os genes relacionados à glicosilação FUT2 e B4GALNT2 mostraram padrões fortes e específicos de cada animal que foram preservados in vitro.
   • FUT2: A expressão foi fortemente reduzida em um animal (A4) tanto nos tecidos quanto nos organoides. Isso correlacionou-se com variantes intrônicas ligadas (uma inserção de trinucleotídeo CGG e um SNP) que segregam com o fenótipo de expressão.
   • B4GALNT2: A expressão separou dois pares de animais (A1/A2 vs. A3/A4) e segregou com variantes candidatas que afetam a expressão proteica ou o processamento de transcritos.

Significância
O artigo conclui que os organoides intestinais suínos adultos retêm um componente epitelial substancial de identidade regional e preservam assinaturas regulatórias específicas de animais selecionadas, apesar de apresentarem redução no padrão espacial para genes de imunidade inata e manterem características de imaturidade transcricional.

Os autores afirmam que esses achados apoiam o uso de biobancos de organoides padronizados, provenientes de porcos genotipados e fenotipados, como sistemas controlados para o acompanhamento funcional de genes, variantes e vias candidatas, particularmente quando o mecanismo biológico de interesse é centrado no epitélio intestinal. O estudo destaca que, embora os organoides padrão sejam adequados para questões centradas no epitélio, eles possuem limites em relação à interação epitélio-imune e estados de maturação, necessitando de uma correspondência entre a complexidade do modelo e a pergunta biológica específica. A preservação de assinaturas específicas de animais, como FUT2 e B4GALNT2, fornece uma prova de conceito de que esses modelos podem revelar variações regulatórias relevantes para a genética de animais de produção.