Spatial gene expression maps in vertebrate limbs display conserved and regenerative species-specific features within connective tissue

Problema
La regeneración es generalizada pero está dispersamente distribuida en el reino animal, y los factores específicos que diferencian a los organismos regenerativos de los no regenerativos siguen siendo poco comprendidos. Un componente central de la regeneración es la información posicional adulta (o memoria posicional), factores que influyen en la identidad y organización celular regional. Si bien se sabe que la información posicional constitutiva adulta es necesaria para la regeneración en invertebrados como los planarias y los acoelos (donde a menudo se alberga en el músculo), su caracterización en vertebrados ha sido limitada. No está claro si el tejido conectivo (TC) de los vertebrados alberga patrones de expresión regional constitutiva similares de factores de desarrollo que puedan servir como un sistema de memoria posicional, y cómo estos patrones difieren entre especies regenerativas y no regenerativas.

Metodología
Los autores generaron atlas exhaustivos de expresión génica espacial para las extremidades de dos modelos de vertebrados: el axolote (Ambystoma mexicanum), una especie altamente regenerativa, y el ratón (Mus musculus), una especie no regenerativa (con la excepción de la regeneración de la punta de los dígitos).

• Recolección de tejidos: Se recolectaron diversos tejidos de las extremidades anteriores e inferiores de ambas especies. Las extremidades se segmentaron a lo largo de los ejes proximal-distal (PD), dorsal-ventral (DV) y anterior-posterior (AP).
• Secuenciación:
  • Secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq): Se realizó en tejidos segmentados de las extremidades para generar atlas de transcriptomas de tipos celulares (aproximadamente 197,000 células de axolote y 86,000 células de ratón).
  • ARN de tipo bulk (Bulk RNA-seq): Se realizó en muestras de piel (epidermis, dermis, hipodermis) de segmentos proximales, mediales y distales para detectar diferencias de expresión PD sin el sesgo de tipos celulares distribuidos de forma no uniforme.
  • Transcriptómica espacial: Se utilizó MERFISH (Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization) para visualizar la expresión de cientos de genes simultáneamente en secciones de tejido completo de las extremidades distales. Se utilizó 10X Genomics Visium HD para la localización espacial de los transcritos en las extremidades de ratón.
• Análisis: Se realizó un análisis de expresión diferencial a través de los ejes de las extremidades (extremidad anterior vs. inferior, PD, DV, AP) para identificar genes expresados constitutivamente. El estudio se centró fuertemente en el tejido conectivo (TC), específicamente en subtipos de fibroblastos, osteoblastos, tenocitos y condrocitos. También se analizaron las extremidades de axolote en regeneración (58 y 68 días post-amputación) y las puntas de los dígitos de ratón en regeneración para comparar los patrones espaciales con el tejido no lesionado.

Contribuciones clave y resultados

1. El tejido conectivo como repositorio de la memoria posicional: El estudio establece que el tejido conectivo de las extremidades de vertebrados adultos, particularmente las diversas poblaciones de fibroblastos, alberga una firma conservada de memoria posicional. Esto incluye la expresión constitutiva de factores de transcripción (TF) de desarrollo y reguladores de señalización que reflejan el patrón del desarrollo.
2. Identidad de extremidad anterior vs. inferior:
   • Ambas especies expresan constitutivamente Tbx5 (extremidad anterior) y Pitx1 (extremidad inferior) en el TC.
   • Los axolotes muestran adicionalmente la expresión de Tbx4 enriquecida en la extremidad inferior en el TC. Los ratones muestran una baja expresión de Tbx4 en extremidades no lesionadas, pero las puntas de los dígitos de la extremidad inferior de ratón en regeneración exhiben una expresión de Tbx4 más fuerte que las puntas de la extremidad anterior, lo que sugiere una memoria posicional latente o reestablecida.
3. Patrón Proximal-Distal (PD):
   • Genes Hox: Un amplio conjunto de genes Hox (grupos 10–13) muestra una expresión constitutiva y de restricción posicional en el TC de la extremidad que recapitula los patrones de desarrollo (por ejemplo, Hoxa13 y Hoxd13 en regiones distales; Hoxa10 y Hoxd10 en regiones proximales). Esta expresión es en gran medida específica del TC.
   • Factores de señalización: A diferencia de los genes Hox, los factores de señalización centrales como los componentes de las vías Fgf, Wnt y RA generalmente no muestran una expresión PD sesgada de forma constitutiva en las extremidades adultas. Sin embargo, los reguladores de estas vías, como Grem1, Sfrp2, Chrdl1 y los TF como Meis1, Meis2 y Tbx15, muestran una expresión sesgada PD en el TC, a menudo reflejando roles de desarrollo.
   • Descubrimiento de nuevos genes: Los autores identificaron Proxima, un nuevo gen que codifica un factor secretado predicho con una fuerte expresión proximal/medial en el TC de axolote. Proxima es específico de vertebrados pero se perdió en los mamíferos.
4. Patrón Dorsal-Ventral (DV) y Anterior-Posterior (AP):
   • Eje DV: El TC del axolote muestra un fuerte enriquecimiento dorsal de Lmx1b, recapitulando los patrones de desarrollo. El TC del ratón carece de este sesgo dorsal, aunque la expresión ventral de En1 en la epidermis se conserva en ambas especies.
   • Eje AP: El TC del axolote muestra una robusta expresión sesgada AP de factores de transcripción clave del desarrollo (Hand2 posterior, Alx4, Alx1, Lhx2, Lhx9 anterior). En contraste, el TC del ratón muestra poca o ninguna expresión sesgada AP de estos factores, lo que sugiere una pérdida o vestigialización de la memoria posicional AP en los mamíferos.
5. Regeneración y reestablecimiento de patrones:
   • En las extremidades de axolote en regeneración, los mapas de expresión espacial de los ejes de extremidad anterior/inferior, PD, AP y DV se reestablecen robustamente a los 58–68 días post-amputación. Los patrones sesgados AP suelen reaparecer antes que los patrones PD.
   • Las puntas de los dígitos de ratón en regeneración también reestablecen la expresión específica de extremidad anterior/inferior (por ejemplo, Tbx5, Tbx4, Hoxa7, Hoxa9) y los patrones de expresión sesgados hacia el extremo distal, indicando que la memoria posicional se reestablece en las células recién formadas incluso en especies no regenerativas.

Significancia
El artículo establece atlas regionales de las extremidades de vertebrados adultos, demostrando que el tejido conectivo de vertebrados tanto regenerativos (axolote) como no regenerativos (ratón) comparte una firma conservada de memoria posicional, albergada principalmente en los fibroblastos y otros tipos de células del TC. Esta firma refleja en gran medida los patrones de expresión del desarrollo, particularmente a lo largo del eje proximal-distal y entre las extremidades anteriores e inferiores.

Los autores sugieren que, si bien el panorama general de la expresión génica sesgada por la posición es parcialmente similar entre los mamíferos y los anfibios regenerativos, elementos específicos —particularmente a lo largo de los ejes AP y DV— están reducidos o ausentes en los ratones. Estas diferencias pueden contribuir a la restricción de la capacidad regenerativa de los mamíferos. El trabajo proporciona un recurso fundamental (incluyendo una base de datos interactiva en digilimb.wi.mit.edu) para identificar objetivos moleculares que podrían ser manipulados para mejorar los resultados regenerativos en especies no regenerativas mediante el aprovechamiento de los sistemas de memoria posicional endógenos. Los hallazgos apoyan un modelo donde diversos tipos de células del TC mantienen la memoria posicional a través de los Bilaterios, con variaciones en la completitud de esta memoria que potencialmente subyacen a las diferencias evolutivas en la capacidad de regeneración.