Spatial gene expression maps in vertebrate limbs display conserved and regenerative species-specific features within connective tissue

Problema
A regeneração é generalizada, porém esparsa através do reino animal, e os fatores específicos que diferenciam organismos regenerativos de não regenerativos permanecem mal compreendidos. Um componente central da regeneração é a informação posicional adulta (ou memória posicional) — fatores que influenciam a identidade regional celular e a organização. Embora a informação posicional constitutiva adulta seja conhecida como necessária para a regeneração em invertebrados como planárias e acóelos (onde é frequentemente abrigada no músculo), sua caracterização em vertebrados tem sido limitada. Não está claro se o tecido conjuntivo (TC) de vertebrados abriga padrões de expressão regional constitutiva semelhantes de fatores de desenvolvimento que poderiam servir como um sistema de memória posicional, e como esses padrões diferem entre espécies regenerativas e não regenerativas.

Metodologia
Os autores geraram atlas abrangentes de expressão gênica espacial para os membros de dois modelos de vertebrados: o axolote (Ambystoma mexicanum), uma espécie altamente regenerativa, e o camundongo (Mus musculus), uma espécie não regenerativa (com exceção da regeneração da ponta da digit/dedo).

• Coleta de Tecidos: Diversos tecidos foram coletados de membros anteriores e posteriores de ambas as espécies. Os membros foram segmentados ao longo dos eixos proximal-distal (PD), dorsal-ventral (DV) e anterior-posterior (AP).
• Sequenciamento:
  • Sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq): Realizado em tecidos segmentados de membros para gerar atlas de transcriptoma de tipos celulares (aproximadamente 197.000 células de axolote e 86.000 células de camundongo).
  • RNA-seq de massa (Bulk RNA-seq): Realizado em amostras de pele (epiderme, derme, hipoderme) de segmentos proximais, mediais e distais para detectar diferenças de expressão PD sem o viés de tipos celulares distribuídos de forma não uniforme.
  • Transcriptômica Espacial: O MERFISH (Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization) foi usado para visualizar a expressão de centenas de genes simultaneamente em seções de tecido completas de membros distais. O 10X Genomics Visium HD foi usado para localização espacial de transcritos em membros de camundongos.
• Análise: A análise de expressão diferencial foi conduzida através dos eixos dos membros (membro anterior vs. posterior, PD, DV, AP) para identificar genes expressos constitutivamente. O estudo focou intensamente no tecido conjuntivo (TC), especificamente em subtipos de fibroblastos, osteoblastos, tenócitos e condrócitos. Membros de axolotes em regeneração (58 e 68 dias pós-amputação) e a regeneração da ponta do dedo de camundongos também foram analisados para comparar os padrões espaciais com o tecido não lesionado.

Principais Contribuições e Resultados

1. O Tecido Conjuntivo como um Repositório de Memória Posicional: O estudo estabelece que o tecido conjuntivo dos membros de vertebrados adultos, particularmente as diversas populações de fibroblastos, abriga uma assinatura conservada de memória posicional. Isso inclui a expressão constitutiva de fatores de transcrição (TF) de desenvolvimento e reguladores de sinalização que espelham o padrão de desenvolvimento.
2. Identidade de Membro Anterior vs. Posterior:
   • Ambas as espécies expressam constitutivamente Tbx5 (membro anterior) e Pitx1 (membro posterior) no TC.
   • Axolotes exibem adicionalmente a expressão de Tbx4 enriquecida em membros posteriores no TC. Camundongos mostram baixa expressão de Tbx4 em membros não lesionados, mas as pontas dos dedos de membros posteriores de camundongos em regeneração exibem uma expressão de Tbx4 mais forte do que as pontas de membros anteriores, sugerindo uma memória posicional latente ou reestabelecida.
3. Padronização Proximal-Distal (PD):
   • Genes Hox: Um amplo conjunto de genes Hox (grupos 10–13) exibe expressão constitutiva e posicionada de forma restrita no TC dos membros, recapitulando padrões de desenvolvimento (ex: Hoxa13 e Hoxd13 em regiões distais; Hoxa10 e Hoxd10 em regiões proximais). Esta expressão é amplamente específica ao TC.
   • Fatores de Sinalização: Ao contrário dos genes Hox, os componentes principais das vias de sinalização como Fgf, Wnt e RA geralmente não exibem expressão PD-enviesada constitutiva nos membros adultos. No entanto, reguladores dessas vias, tais como Grem1, Sfrp2, Chrdl1 e TFs como Meis1, Meis2 e Tbx15, mostem expressão enviesada em PD no TC, frequentemente espelhando funções de desenvolvimento.
   • Descoberta de Novo Gene: Os autores identificaram o Proxima, um novo gene que codifica um fator predito secretado com forte expressão proximal/medial no TC de axolote. Proxima é específico de vertebrados, mas perdido em mamíferos.
4. Padronização Dorsal-Ventral (DV) e Anterior-Posterior (AP):
   • Eixo DV: O TC do axolote mostra forte enriquecimento dorsal de Lmx1b, recapitulando padrões de desenvolvimento. O TC do camundongo carece desse viés dorsal, embora a expressão ventral da epiderme de En1 seja conservada em ambas as espécies.
     • Eixo AP: O TC do axolote exibe robusta expressão enviesada em AP de TFs de desenvolvimento chave (Hand2 posterior, Alx4, Alx1, Lhx2, Lhx9 anterior). Em contraste, o TC do camundongo mostra pouca ou nenhuma expressão enviesada em AP desses fatores, sugerindo uma perda ou vestigialização da memória posicional AP em mamíferos.
5. Regeneração e Reestabelecimento de Padrões:
   • Nos membros de axolote em regeneração, os mapas de expressão espacial dos eixos membro anterior/posterior, PD, AP e DV são robustamente reestabelecidos por 58–68 dias pós-amputação. Padrões enviesados em AP frequentemente reaparecem antes dos padrões PD.
   • As pontas dos dedos de camundongos também em regeneração reestabelecem a expressão específica de membro anterior/posterior (ex: Tbx5, Tbx4, Hoxa7, Hoxa9) e padrões de expressão enviesados em distal, indicando que a memória posicional é reestabelecida em novas células formadas mesmo em espécies não regenerativas.

Significância
O artigo estabelece atlas regionais de membros de vertebrados adultos, demonstrando que o tecido conjuntivo de ambos os vertebrados regenerativos (axolote) e não regenerativos (camundongo) compartilha uma assinatura conservada de memória posicional, primordialmente abrigada em fibroblastos e outros tipos celulares de TC. Esta assinatura amplamente recapitula os padrões de expressão do desenvolvimento, particularmente ao longo do eixo proximal-distal e entre membros anteriores e posteriores.

Os autores sugerem que, embora o panorama amplo de expressão gênica enviesada em posição seja parcialmente semelhante entre mamíferos e anfíbios regenerativos, elementos específicos — particularmente ao longo dos eixos AP e DV — são reduzidos ou ausentes em camundongos. Essas diferenças podem contribuir para a restrição da capacidade regenerativa de mamíferos. O trabalho fornece um recurso fundamental (incluindo um banco de dados interativo em digilimb.wi.mit.edu) para identificar alvos moleculares que poderiam ser potencialmente manipulados para melhorar os resultados regenerativos em espécies não regenerativas, aproveitando sistemas de memória posicional endógenos. As descobertas apoiam um modelo onde diversos tipos de células de TC mantêm a memória posicional através de Bilateria, com variações na completude dessa memória possivelmente subjacentes às diferenças evolutivas na capacidade regenerativa.