Multiscale three-dimensional ultrastructural mapping of intestinal tissues and organoids

Problema
Comprender la biología celular dentro de los entornos nativos requiere la obtención de imágenes de la organización subcelular en tres dimensiones. En el epitelio intestinal, las interfaces célula-célula y la arquitectura subcelular son críticas para la diferenciación y la función tisular; sin embargo, resolver estas características volumétricamente sigue siendo un desafío significativo. La microscopía óptica convencional ofrece especificidad molecular pero sufre de resolución limitada y dispersión óptica, mientras que la microscopía electrónica (EM) proporciona detalles ultraestructurales pero es poco adecuada para la adquisición volumétrica combinada con el marcaje de proteínas específicas. En consecuencia, la organización a escala de tejido y la ultraestructura subcelular suelen analizarse por separado utilizando diferentes modalidades. Además, aunque los organoides intestinales se utilizan ampliamente como modelos in vitro, su validación ultraestructural se ha limitado en gran medida a imágenes de EM bidimensionales dispersas, careciendo de la obtención de imágenes volumétricas de alta resolución necesaria para validar plenamente los simuladores de tejido.

Metodología
Los autores establecieron un flujo de trabajo optimizado de Microscopía de Expansión Ultraestructural (U-ExM) adaptado para secciones de tejido de intestino delgado de ratón y modelos de organoides. Las adaptaciones metodológicas clave incluyeron:

• Fijación: Uso de paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón PHEM para preservar mejor la arquitectura del citoesqueleto y la ultraestructura en comparación con la fijación estándar basada en PBS.
• Infiltración de gel y homogeneización: Tiempos de incubación extendidos para las soluciones de gelificación con el fin de mejorar la penetración de los monómeros en tejidos densos. Para las secciones de tejido, las muestras fueron desnaturalizadas en un autoclave (126 °C durante 2 horas); para los organoides, se utilizó la incubación en bloque de calor (98 °C durante 3 horas) para lograr una homogeneización completa preservando la organización epitelial.
• Estrategias de marcaje: El flujo de trabajo integró tanto el marcaje de anticuerpos pre-expansión como post-expansión. El marcaje pre-expansión se dirigió a los epítopos antes de la modificación estructural, mientras que el marcaje post-expansión (incluyendo el tinte terciario) redujo el error de enlace y mejoró la densidad de la señal. El marcaje de proteínas totales se logró mediante colorantes NHS-ester.
• Segmentación: Se desarrolló un flujo de trabajo de segmentación personalizado de "humano en el bucle" (human-in-the-loop), combinando el marcaje de proteínas totales con NHS-ester y las señales de CAAX-tdTomato localizadas en la membrana y DAPI. Esto utilizó herramientas como SAM2, Cellpose y algoritmos de watershed sembrados para reconstruir cuerpos celulares individuales dentro de volúmenes de criptas completos.

Contribuciones clave y resultados

• Imagen multiescala de tejido nativo: El flujo de trabajo optimizado permitió la obtención de imágenes de múltiples unidades cripta-vellosidad continuas en un único panorama compuesto. Preservó la arquitectura del tejido, permitiendo la reconstruación de criptas individuales y la visualización del nicho de la cripta, incluyendo las células de Paneth y las células madre intestinales (ISC). A resolución subcelular, el método resolvió la organización del borde en cepillo (que varía de densa en la punta de la vellosidad a menos organizada cerca de la cripta) y las complejas interdigitaciones de la membrana lateral entre enterocitos.
• Validación de organoides: El flujo de trabajo se adaptó con éxito a organoides de intestino delgado de ratón. Los organoides expandidos retuvieron su arquitectura general, revelando múltiples dominios similares a criptas dentro de una estructura epitelial continua. El método permitió una comparación directa de la organización epitelial entre el tejido nativo y los sistemas de organoides, confirmando que los organoides recapitulan características arquitectónicas y ultraestructurales clave, incluyendo morfologías específicas de tipos celulares (enterocitos, células caliciformes, células de Paneth) y la polaridad apico-basal.
• Anotación molecular: El estudio demostró la compatibilidad con el marcaje de anticuerpos dirigido tanto antes como después de la expansión. Marcadores específicos como GM130 (Golgi), Lisozima (células de Paneth) y OLFM4 (ISC) fueron visualizados con éxito dentro del contexto ultraestructural proporcionado por el tinte de proteínas totales.
• Segmentación 3D cuantitativa: Los autores lograron la segmentación volumétrica a escala nanométrica de epitelios de criptas enteros. Esto reveló subconjuntos distintos de células pequeñas y altamente elongadas de tipo ISC que eran difíciles de identificar en secciones 2D debido a su limitada área de sección transversal. La reconstrucción 3D destacó las extensas interfaces entre células elongadas y células de Paneth, así como geometrías de tipo "scutoid" asociadas con el intercambio de vecinos apico-basales.
• Modelado de enfermedades: El flujo de trabajo se aplicó a un modelo de organoide de enfermedad de inclusión de microvellosidades (MVID) (knockout inducible de Myo5b). La U-ExM visualizó con éxito los fenotipos ultraestructurales asociados a la enfermedad, incluyendo microvellosidades apicales reducidas, acumulación de estructuras vesiculares subapicales, lisosomas (auto)grandes y microvellosidades inclusiones intracelulares. Estas características, que anteriormente requerían EM para su detección, se resolvieron volumétricamente dentro del contexto del organoide intacto.

Significancia
El artículo establece la U-ExM como una tecnología clave para estudiar la biología celular tridimensional dentro del tejido intestinal y sus simuladores de tejido. Al cerrar la brecha entre la microscopía óptica y la microscopía electrónica, el flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multiescala, cuantitativas y molecularmente anotadas de sistemas epiteliales intactos. Los autores afirman que este enfoque proporciona una plataforma para validar los modelos de organoides más allá del perfilado transcripcional, ofreciendo una comparación volumétrica directa entre el tejido nativo y los sistemas in vitro. Además, la capacidad de visualizar defectos ultraestructurales asociados a enfermedades en 3D sin la complejidad de la EM sugiere la utilidad del método para estudiar estados patológicos que involucran alteraciones de la ultraestructura epitelial, como la enfermedad celíaca y la enfermedad inflamatoria intestinal. El estudio posiciona a la U-ExM como un espacio intermedio accesible que combina el tinte de anticuerpos específicos, el contexto volumétrico y la lectura ultraestructural, facilitando nuevos conocimientos sobre la complejidad organizativa de tipos celulares especializados durante la diferenciación y la enfermedad.