Multiscale three-dimensional ultrastructural mapping of intestinal tissues and organoids

Problema
Compreender a biologia celular em ambientes nativos requer o mapeamento da organização subcelular em três dimensões. No epitélio intestinal, as interfaces célula-célula e a arquitetura subcelular são críticas para a diferenciação e função tecidual, mas resolver essas características volumetricamente permanece um desafio significativo. A microscopia de luz convencional oferece especificidade molecular, mas sofre com resolução limitada e dispersão óptica, enquanto a microscopia eletrônica (EM) fornece detalhes ultraestruturais, mas é mal adequada para a aquisição volumétrica combinada com a marcação de proteínas específicas. Consequentemente, a organização em escala de tecido e a ultraestrutura subcelular são frequentemente analisadas separadamente usando diferentes modalidades. Além disso, embora os organoides intestinais sejam amplamente utilizados como modelos in vitro, sua validação ultraestrutural tem sido amplamente restrita a imagens esparsas de EM em duas dimensões, carecendo da imagem volumétrica de alta resolução necessária para validar plenamente os mímicos de tecido.

Metodologia
Os autores estabeleceram um fluxo de trabalho otimizado de Microscopia de Expansão Ultrestrutural (U-ExM) adaptado para seções de tecido de intestino delgado de camundongo e modelos de organoides. As adaptações metodológicas principais incluíram:

• Fixação: Uso de paraformaldeído (PFA) a 4% em tampão PHEM para preservar melhor a arquitetura do citoesqueleto e a ultraestrutura em comparação com a fixação padrão baseada em PBS.
• Infiltração de Gel e Homogeneização: Tempos de incubação estendidos para as soluções de gelificação para melhorar a penetração de monômeros em tecidos densos. Para seções de tecido, as amostras foram desnaturadas em uma autoclave (126°C por 2 horas); para organoides, a incubação em bloco de calor (98°C por 3 horas) foi utilizada para alcançar a homogeneização completa preservando a organização epitelial.
• Estratégias de Marcação: O fluxo de trabalho integrou tanto a marcação de anticorpos pré-expansão quanto pós-expansão. A marcação pré-expansão visou epítopos antes da modificação estrutural, enquanto a marcação pós-expansão (incluindo coloração terciária) reduziu o erro de ligação e aumentou a densidade do sinal. A marcação de proteína total foi alcançada usando corantes NHS-ester.
• Segmentação: Um fluxo de trabalho de segmentação customizado "human-in-the-loop" foi desenvolvido, combinando a marcação de proteína total com NHS-ester e sinais de CAAX-tdTomato localizados na membrana e DAPI. Isso utilizou ferramentas como SAM2, Cellpose e algoritmos de watershed semeados para reconstruir corpos celulares individuais dentro de volumes de criptas inteiras.

Contribuições Principais e Resultados

• Imagem Multiescala de Tecido Nativo: O fluxo de trabalho otimizado permitiu a imagem de múltiplas unidades cripta-vilosidade contínuas em uma única visão geral costurada. Preservou a arquitetura do tecido, permitindo a reconstrução de criptas individuais e a visualização do nicho da cripta, incluindo células de Paneth e células-tronco intestinais (ISCs). Na resolução subcelular, o método resolveu a organização da borda em escova (variando de densa na ponta da vilosidade a menos organizada perto da cripta) e complexas interdigitações de membranas laterais entre enterócitos.
• Validação de Organoides: O fluxo de trabalho foi adaptado com sucesso para organoides de intestino delgado de camundongo. Os organoides expandidos mantiveram sua arquitetura geral, revelando múltiplos domínios do tipo cripta dentro de uma estrutura epitelial contínua. O método permitiu a comparação direta da organização epitelial entre tecido nativo e sistemas de organoides, confirmando que os organoides recapitulam características arquitetônicas e ultraestruturais fundamentais, incluindo morfologias específicas de tipos celulares (enterócitos, células caliciformes, células de Paneth) e polaridade apico-basal.
• Anotação Molecular: O estudo demonstrou compatibilidade com a marcação de anticorpos direcionados tanto antes quanto depois da expansão. Marcadores específicos como GM130 (Golgi), Lisozima (células de Paneth) e OLFM4 (ISCs) foram visualizados com sucesso dentro do contexto ultraestrutural fornecido pela coloração de proteína total.
• Segmentação 3D Quantitativa: Os autores alcançaram a segmentação volumétrica em nanoescala de epitélios de criptas inteiros. Isso revelou subconjuntos distintos de células pequenas e altamente alongadas do tipo ISC que eram difíceis de identificar em seções 2D devido à área de seção transversal limitada. A reconstrução 3D destacou extensas interfaces entre células alongadas e células de Paneth, bem como geometrias do tipo "scutoid" associadas à troca de vizinhança apico-basal.
• Modelagem de Doenças: O fluxo de trabalho foi aplicado a um modelo de organoide de Doença de Inclusão de Microvilosidades (MVID) (knockout induzível de Myo5b). A U-ExM visualizou com sucesso fenótipos ultraestruturais associados à doença, incluindo microvilosidades apicais reduzidas, acúmulo de estruturas vesiculares subapicais, lisossomos (auto)grandes e inclusões de microvilosidades intracelulares. Essas características, que anteriormente exigiam EM para detecção, foram resolvidas volumetricamente dentro do contexto intacto do organoide.

Significância
O artigo estabelece a U-ExM como uma tecnologia fundamental para estudar a biologia celular tridimensional dentro de tecido intestinal e mímicos de tecido. Ao unir a lacuna entre a microscopia de luz e a microscopia eletrônica, o fluxo de trabalho permite a imagem multiescala quantitativa e molecularmente anotada de sistemas epiteliais intactos. Os autores afirmam que esta abordagem fornece uma plataforma para validar modelos de organoides além do perfil de transcrição, oferecendo uma comparação volumétrica direta entre o tecido nativo e sistemas in vitro. Além disso, a capacidade de visualizar defeitos ultraestruturais associados a doenças em 3D sem a complexidade da EM sugere a utilidade do método para estudar estados patológicos envolvendo alteração da ultraestrutura epitelial, como a Doença Celíaca e a Doença Inflamatória Intestinal. O estudo posiciona a U-ExM como um espaço intermediário acessível que combina coloração de anticorpos específica, contexto volumétrico e leitura ultraestrutural, facilitando novos insights sobre a complexidade organizacional de tipos celulares especializados durante a diferenciação e a doença.