Three-dimensional Imaging of Colonial Cyanobacteria with Optical Coherence Tomography

Resumen Técnico: Imagen tridimensional de cianobacterias coloniales mediante tomografía de coherencia óptica

Planteamiento del problema
La morfología de las colonias de cianobacterias es un determinante crítico de su éxito ecológico, lo que influye en la migración vertical, la resistencia al pastoreo y la disponibilidad de luz. A pesar de esto, las técnicas de imagen actuales son insuficientes para caracterizar completamente la compleja arquitectura tridimensional (3D) de estas colonias. La microscopía de campo amplio proporciona información de profundidad limitada, mientras que la microscopía de fluorescencia confocal está restringida por profundidades de imagen poco profundas y la pérdida de fluorescencia en muestras fijadas. Además, los métodos existentes para estimar el biovolumen de las colonias suelen basarse en supuestos de formas esféricas idealizadas, sin tener en cuenta las estructuras irregulares, ramificadas y porosas observadas en la naturaleza. Existe una necesidad clara de una técnica de imagen 3D no invasiva capaz de resolver características de mesoescala (desde unas pocas células hasta varios milímetros) con una preparación de muestra mínima.

Metodología
Los autores presentan un protocolo que utiliza la Tomografía de Coherencia Óptica (OCT) para obtener imágenes de colonias de cianobacterias de agua dulce en suspensión.

• Preparación de la muestra: Se recolectaron colonias flotantes de lagos holandeses, se concentraron y se inyectaron en cámaras de imagen compuestas por dos superficies de vidrio separadas por un espaciador (0.5–2 mm). Las cámaras se inclinaron a 10° respecto al eje de imagen del escáner OCT para minimizar las reflexiones del vidrio.
• Sistema de imagen: Se utilizó un sistema de OCT de dominio espectral (Telesto 221C1) que opera a 1300 nm. El sistema ofrecía una resolución axial de 4.2 µm y una resolución lateral de 13 µm, con un campo de visión de hasta 10 x 10 mm y una profundidad de imagen superior a 2.0 mm.
• Flujo de procesamiento de imágenes: Se desarrolló un flujo automatizado (implementado en Python utilizando scikit-image) para procesar los escaneos 3D brutos. Los pasos incluyeron la reducción de ruido mediante desenfoque gaussiano, la detección de las superficies de vidrio mediante una transformada de Hough para corregir la inclinación, el enmascaramiento de la región de interés, el umbral de Otsu para separar las colonias del fondo y el etiquetado de componentes conectados para segmentar las colonias individuales.
• Extracción de características: A partir de las imágenes binarias 3D resultantes, se cuantificaron características morfológicas de mesoescala, incluyendo el diámetro esférico equivalente ($D_{es}$), el diámetro circular equivalente ($D_{ec}$), el diámetro de Feret ($D_f$), el conteo de ramas, el conteo de túneles y los volúmenes de vacío. Se utilizaron algoritmos de esqueletización para analizar la ramificación de las colonias.
• Validación comparativa: Se evaluó el impacto de las vesículas de gas intracelulares en la señal de OCT comparando escaneos de colonias de Dolichospermum antes y después de colapsar las vesículas mediante tratamiento con nitrógeno a alta presión. Los resultados también se compararon con la microscopía de fluorescencia confocal y la microscopía de campo claro.
• Modelado ecológico: Los datos morfológicos 3D se aplicaron a dos modelos ecológicos: (1) la estimación de la velocidad de flotación utilizando una ley de Stokes modificada que incorpora un factor de forma derivado de la geometría 3D, y (2) el modelado de la atenuación de la luz intracolonial mediante una ley de Lambert-Beer extendida promediada sobre todas las orientaciones.

Resultados clave

• Contraste de las vesículas de gas: Las vesículas de gas actúan como potentes agentes de contraste naturales para la OCT. Las vesículas intactas produjeron una relación señal-ruido (SNR) máxima de 14 dB, mientras que las vesículas colapsadas redujeron la SNR a 6 dB. A pesar de esta reducción, la OCT mantuvo un contraste suficiente para obtener imágenes de toda la profundidad de la colonia incluso con las vesículas colapsadas, a diferencia de la microscopía confocal, donde la atenuación de la señal con la profundidad fue severa.
• Validación de especies: La OCT visualizó con éxito las estructuras 3D de varios taxones, incluyendo Aphanizomenon (forma de balsa), Dolichospermum (entrelazada), Gloeotrichia (esférica radiante) y tres moroespecies de Microcystis. Aunque las células individuales no eran resolubles debido al límite de resolución lateral, la técnica capturó características de mesoescala como la ramificación, el aplanamiento y la porosidad.
• Análisis morfológico de Microcystis: El análisis de 213 colonias de Microcystis reveló que las proyecciones 2D sobreestiman sistemáticamente el volumen de la colonia en comparación con las mediciones 3D. A medida que las colonias crecían, se desviaban significativamente de las formas esféricas, transitando hacia estructuras ramificadas y aplanadas.
  • El número de ramas y túneles aumentó con el tamaño de la colonia.
  • El grosor de las ramas se mantuvo relativamente constante (~65 µm) independientemente del tamaño de la colonia, lo que sugiere que las colonias crecen añadiendo ramas en lugar de engrosando las existentes.
• Implicaciones ecológicas:
  • Velocidad de flotación: El factor de forma ($\psi$) de las colonias irregulares aumentó con el tamaño, causando que la velocidad de flotación escalara con el diámetro a la potencia de ~1.33 ($U \sim D_{ec}^{1.33}$) en lugar del cuadrado ($D^2$) predicho por la ley de Stokes para esferas. Esto resulta en una flotación más lenta para las colonias grandes e irregulares en comparación con las esferas idealizadas.
  • Disponibilidad de luz: Las morfologías irregulares y ramificadas mejoraron significamente la disponibilidad de luz en el interior de la colonia en comparación con las esferas sólidas. La estructura ramificada redujo el auto-sombreo, permitiendo que la luz penetrara más profundamente en el volumen de la colonia.

Significancia y afirmaciones
El artículo demuestra que la OCT es una técnica viable y no invasiva para obtener imágenes volumétricas de colonias de cianobacterias de hasta varios milímetros de tamaño. Los autores afirman que este método proporciona un protocolo estandarizado para la adquisición de datos 3D que revela características morfológicas de mesoescala previamente inaccesibles para la microscopía estándar.

El estudio sostiene que los conjuntos de datos 3D derivados ofrecen una corrección para los sesgos de proyección en la estimación del biovolumen y proporcionan un método directo para calcular los factores de forma necesarios para modelar la distribución vertical de las cianobacterias en las columnas de agua. Además, los resultados apoyan la hipótesis de que las colonias de Microcystis experimentan una transición morfológica de formas compactas y casi esféricas hacia morfotipos ramificados y no esféricos a medida que crecen, un proceso que mejora la captura de luz y modula la flotación. Los autores anticipan que la OCT se convertirá en una herramienta clave para monitorear las poblaciones de cianobacterias e investigar la formación de colonias, con potencial aplicabilidad a otras organizaciones coloniales y agregadas en entornos acuáticos.