Genome-resolved multi-omics characterization of Lentilactobacillus buchneri subsp. silagei strain AGA55 from Turkish shalgam: taxogenomics, safety, and probiotic-functional potential

Resumen Técnico: Caracterización Multiómica de Resolución Genómica de Lentilactobacillus buchneri subsp. silagei Cepa AGA55

Planteamiento del Problema
Aunque Lentilactobacillus buchneri es ampliamente reconocido por su papel en la fermentación de ensilados y su capacidad metabólica para convertir el ácido láctico en ácido acético y 1,2-propanodiol, la subespecie Llb. buchneri subsp. silagei permanece insuficientemente caracterizada con respecto a su potencial probiótico y diversidad genómica. Específicamente, existe una falta de datos multiómicos sistemáticos que vinculen la taxonomía, el perfil de seguridad y los rasgos funcionales (como la actividad antioxidante, la asimilación de colesterol y el potencial anticancerígeno) de las cepas de Llb. buchneri aisladas de alimentos fermentados tradicionales como el shalgam turco. Este estudio aborda la brecha en la comprensión de la posición taxogenómica, el moviloma, el resistoma y la versatilidad funcional de una nueva cepa, AGA55, aislada de un jugo de shalgam turco disponible comercialmente.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multiómico integrado de resolución genómica combinando bioinformática in silico con una extensa caracterización fenotípica in vitro:

• Taxogenómica y Pangenómica: El genoma de la cepa AGA55 fue secuenciado (Illumina NovaSeq 6000) y ensamblado. La ubicación taxonómica se confirmó mediante la Identidad de Nucleótidos Promedio (ANI) y la hibridación digital ADN-ADN (dDDH) contra 26 genomas de referencia. El análisis del pangenoma (27 cepas) utilizó PanACoTA y Pan-genome Explorer para delinear los grupos de genes esenciales (core), accesorios (dispensable) y únicos (singleton).
• Moviloma y Resistoma: Las regiones de profagos se identificaron mediante PHASTEST y se perfilaron las secuencias de inserción (IS). La resistencia a los antibióticos se evaluó tanto fenotípicamente (difusión en disco según las directrices de CLSI) como genómicamente (bases de datos BV-BRC, KEGG y NCBI NR), con especial atención a la verificación de la transferencia horizontal de genes (HGT) mediante comprobaciones de homología por proteína-BLAST.
• Metabolómica y Fenotipado: Los sobrenadantes libres de células (CFS) se analizaron mediante GC-MS para el perfilado de metabolitos. Los ensayos in vitro evaluaron:
  • Rasgos probióticos: Hemólisis, autoagregación, hidrofobicidad de la superficie celular y supervivencia bajo condiciones gastrointestinales simuladas (protocolo INFOGEST).
  • Potencial funcional: Actividad antioxidante (DPPH y ABTS⁺), asimilación de colesterol y actividad antimicrobiana contra bacterias patógenas.
  • Citotoxicidad: Efectos dependientes de la dosis en líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal HT-29 y DLD-1 utilizando el ensayo CCK-8.
  • Perfil metabólico: Los patrones de fermentación de carbohidratos se determinaron mediante kits API 50 CH y se correlacionaron con las anotaciones genómicas de transportadores y CAZymes.

Resultados Clave

• Asignación Taxogenómica: Los análisis de ANI y dDDH confirmaron que AGA55 pertenece a Llb. buchneri subsp. silagei. El análisis reveló una distribución bimodal de las distancias genéticas entre 27 cepas, lo que sugiere al menos dos subgrupos genómicos distintos dentro del complejo de especies. AGA55 se agrupó estrechamente con cepas aisladas de ensilados y nasofaringe bovina, así como de mosto de uva.
• Plasticidad Genómica: El pangenoma de Llb. buchneri es "abierto" (α = 0.594), lo que indica una plasticidad genómica significativa y una transferencia horizontal de genes continua. AGA55 posee un conjunto distinto de 100 genes únicos (singleton), muchos de ellos anotados como proteínas hipotéticas involucradas en la transcripción, reparación del ADN y biogénesis de la envoltura celular.
• Moviloma: El genoma contiene dos regiones de tipo profago intactas (46.6 kb y 53.5 kb) y un repertorio diverso de 41 secuencias de inserción, predominantemente elementos de la familia IS6, lo que respalda una historia de remodelación genómica mediada por fagos y transposones.
• Perfil de Seguridad: Se observó resistencia fenotípica a los aminoglucósidos y la vancomicina, consistente con los rasgos intrínsecos de los lactobacilos. El cribado genómico confirmó que todos los determinantes de resistencia son cromosómicos e intrínsecos; no se detectaron genes de resistencia transferibles (por ejemplo, tet, erm adquiridos o operones completos de glucopéptidos). La cepa no mostró actividad hemolítica.
• Potencial Probiótico y Funcional:
  • Supervivencia Gastrointestinal: AGA55 demostró una supervivencia robusta en fluidos gástricos e intestinales simulados, con una viabilidad que se recuperó a ~93% tras la exposición intestinal.
  • Adhesión: La cepa exhibió una alta autoagregación (81.60%) y una hidrofobicidad superficial moderada.
  • Actividad Antioxidante: El CFS mostró una potente actividad de eliminación de radicales (73.14% DPPH; 73.03% ABTS⁺), vinculada a ácidos orgánicos secretados, poliolos y el dipeptido cíclico cyclo(L-Pro-L-Leu).
  • Asimilación de Colesterol: Se observó una tasa de asimilación moderada del 37.04%, respaldada por la presencia de hidrolasa de sales biliares (cbh) y enzimas de la vía del mevalonato.
  • Actividad Antimicrobiana: El CFS inhibió patógenos Gram-positivos y Gram-negativos, probablemente debido a los ácidos orgánicos y los dipeptidos cíclicos.
  • Citotoxicidad: El CFS ejerció citotoxicidad dependiente de la concentración contra células cancerosas colorrectales. Las células DLD-1 fueron significativamente más sensibles (IC₅₀ = 3.44 mg/mL) que las HT-29 (IC₅₀ = 8.55 mg/mL).
• Versatilidad Metabólica: AGA55 es una bacteria heterofermentativa obligada que utiliza la vía de la fosfoquetolasa. Fermenta una amplia gama de sustratos derivados de plantas, incluyendo pentosas (L-arabinosa, D-ribosa) y glucósidos (salicina, amigdalina), consistente con su aislamiento de una bebida fermentada de base vegetal.

Significancia y Afirmaciones
Los autores afirman que este estudio establece a AGA55 como una cepa metabólicamente versátil con un notable potencial probiótico y biotecnológico. Las contribuciones clave incluyen:

1. Resolución Taxonómica: Proporcionar la primera caracterización de resolución genómica de una cepa de Llb. buchneri subsp. silagei de shalgam turco, confirmando su asignación de subespecie y destacando los subgrupos genómicos dentro de la especie.
2. Validación de Seguridad: Demostrar que los rasgos de resistencia son intrínsecos y no transferibles, apoyando la seguridad de la cepa para posibles aplicaciones alimentarias o probióticas.
3. Caracterización Funcional: Descubrir un perfil funcional multifacético, que incluye una fuerte capacidad antioxidante, reducción moderada de colesterol y una citotoxicidad específica contra líneas celulares de cáncer colorrectal, particularmente la línea DLD-1 poco diferenciada.
4. Relevancia Biotecnológica: Sugerir una utilidad potencial como inoculante de ensilados debido a su metabolismo formador de acetato y su capacidad para utilizar sustratos derivados de plantas, aunque los autores declaran explícitamente que esto requiere validación mediante experimentos de ensilado controlados.

El artículo concluye que, si bien AGA55 amerita más investigación in vivo para confirmar su eficacia probiótica, los datos integrados genómicos, metabolómicos y fenotípicos proporcionan una base sólida para su consideración en aplicaciones relacionadas con la salud y la fermentación de alimentos.