Hybrid G-Quadruplex and i-Motif Formation in G/C-Rich Repeat DNA: Beyond the Competitive Paradigm

Resumen Técnico: Formación de G-Cuadruplexo y i-Motivo Híbridos en ADN con Repeticiones Ricas en G/C

Planteamiento del Problema
Los G-cuadruplexos (G4) y los i-motivos (iM) se consideran tradicionalmente como estructuras mutuamente excluyentes que se forman en las hebras complementarias ricas en guanina (rica en G) y ricas en citosina (rica en C), respectivamente. Los G4s son estabilizados por enlaces de hidrógeno de Hoogsteen y cationes monovalentes, mientras que los i-motivos dependen de pares de bases C•C⁺ hemiprotonados bajo condiciones ácidas. El paradigma prevaleciente sugiere que la formación de una estructura impide la otra debido a restricciones topológicas y estructurales. Sin embargo, esta visión puede ser excesivamente simplista para secuencias intrínsecamente ricas en G/C, particularmente repeticiones en tándem como C₃G₂ y G₃C₂. Aunque los predictores basados en secuencias (por ejemplo, G4Hunter) indican que estos motivos carecen de la propensión intrínseca suficiente para formar G4s o iMs estables, y los modelos termodinámicos favorecen los dúplex de Watson–Crick canónicos, su comportamiento conformacional bajo diversas condiciones fisicoquímicas sigue siendo poco comprendido. Este estudio aborda la brecha en la comprensión de cómo las repeticiones en tándem ricas en G/C navegan el equilibrio entre el ADN dúplex y otras estructuras de orden superior alternativas, investigando específicamente si los G4s y los iMs pueden coexistir o acoplarse estructuralmente en lugar de competir.

Metodología
Los investigadores emplearon una serie de oligonucleótidos de ADN de diseño sistemático que contienen tractos en tándem de G₂ y C₃ (por ejemplo, C₃G₂, G₂C₃, G₃C₂ y sus variantes con bases flanqueantes terminales o sustituciones de timina). El estudio utilizó un enfoque biofísico multifacético para caracterizar las transiciones estructurales:

• Espectroscopía de Dicroísmo Circular (CD): Utilizada para monitorear la topología estructural (paralela vs. antiparalela) y la estabilidad a través de un rango de temperatura (0–100 °C) y niveles de pH variables (5.0 y 7.4).
• Análisis Termodinámico: Las curvas de fusión se analizaron para determinar las temperaturas de fusión ($T_m$), la entalpía ($\Delta H$), la energía libre de Gibbs ($\Delta G$) y la cooperatividad (Ancho Completo a la Mitad del Máximo, FWHM) .
• Titulación de Iones: Se realizaron experimentos en presencia de concentraciones variables de iones K⁺ y Na⁺ (2.5–100 mM) para evaluar la dependencia de los cationes.
• Movilidad Electroforética: Se utilizaron PAGE no desnaturalizantes y desnaturalizantes para evaluar la compacidad y el estado de plegamiento de los oligonucleótidos.
• Espectroscopía de Diferencia de Temperatura (TDS): Empleada para confirmar firmas espectrales específicas de G4.

Resultos Clave

1. Formación de G4 Dependiente del pH en Secuencias de "Baja Propensión": Contrariamente a las predicciones de secuencia, las secuencias C₃G₂ y T[C₃G₂]A formaron estructuras de G-cuadruplexo estables y sensibles al pH bajo condiciones ácidas (pH 5.0) en presencia de iones K⁺. Estas estructuras exhibieron firmas de CD antiparalelas características (banda positiva a ~295 nm, banda negativa a ~240/273 nm) y perfiles de TDS consistentes con G4 plegados. Esta formación estuvo ausente a pH 7.4 y dependió estrictamente de la presencia de cuatro tractos GG intactos.
2. Acoplamiento Estructural de Características de G4 e i-Motivo: El estudio demuestra que los G4s y los i-motivos no son estrictamente antagónicos. En el sistema C₃G₂, las interacciones dependientes de la protonación de C•C⁺ parecen estabilizar la topología del G4. Los autores proponen un modelo donde los pares C•C⁺ se forman dentro de los bucles o en las regiones terminales de un núcleo de G4 antiparalelo de dos tetrádas, actuando efectivamente como un "capuchón" (capping) de la estructura. Este acoplamiento reduce la heterogeneidad conformacional y estabiliza arquitecturas de G4 que de otro modo serían marginalmente estables.
3. Orientación de la Secuencia y Estabilidad: Aunque C₃G₂ y G₂C₃ comparten composiciones de bases similares, sus comportamientos estructurales difieren ligeramente debido a la orientación. G₂C₃ mostró una capacidad única para formar firmas tipo i-motivo bajo condiciones ácidas libres de iones, mientras que C₃G₂ no lo hizo. La variante G₃C₂ (relación G:C invertida) formó un G4 antiparalelo de tres tétradas altamente estable, reforzado por interacciones laterales de C•C⁺, exhibiendo una estabilidad termodinámica significativamente mayor ($\Delta G \approx -30$ kJ/mol a 25 °C) que la variante C₃G₂.
4. Especificidad de Cationes y Cooperatividad: La formación de estas estructuras híbridas dependió altamente de los iones K⁺; el Na⁺ no apoyó la formación de G4, probablemente debido a una estabilización insuficiente del núcleo de G-tétrada. El análisis termodinámico reveló que las secuencias que contienen C (C₃G₂, T[C₃G₂]A) mostraron transiciones de fusión más amplias (FWHM ~24–26 °C) en comparación con las transiciones estrechas y altamente cooperativas del control de solo timina (T₃G₂, FWHM ~17 °C). Esto sugiere un proceso de desplegamiento de múltiples pasos que involucra la coexistencia de dominios de interacción distintos (núcleo de G-tétrada y regiones estabilizadas por C•C⁺).
5. Comportamiento Electroforético: A pesar de la expectativa de que la protonación de C•C⁺ reduciría la carga negativa y disminuiría la movilidad, las estructuras plegadas de C₃G₂ y T[C₃G₂]A exhibieron una mayor movilidad electroforética en comparación con sus formas desnaturalizadas. Esto indica que la reducción en el volumen hidrodinámico debido a la formación de estructuras altamente compactas supera los efectos de la carga.

Significancia y Reivindicaciones
El artículo argumenta que la relación entre los G4 y los i-motivos debe ser reevaluada de un paradigma puramente competitivo a uno de acoplamiento estructural y funcional. Los autores afirman que:

• La Coexistencia es Posible: En las regiones genómicas ricas en G/C, las características de G4 e i-motivo pueden coexistir dentro del mismo contexto de secuencia, actuando de manera cooperativa en lugar de antagónica.
• La Protonación como Estabilizador: La protonación de la citosina (C•C⁺) no es meramente un motor para la formación del i-motivo, sino que puede influir directamente en la topología y la estabilidad del G4, expandiendo los mecanismos conocidos de la arquitectura de ADN sensible al pH.
• Relevancia Biológica: Estos hallazgos sugieren que las repeticiones en tándem C₃G₂ y G₃C₂, que están ampliamente distribuidas en las regiones reguladoras del genoma humano, pueden funcionar como interruptores conformacionales finamente ajustables. Su capacidad para responder a fluctuaciones fisicoquímicas sutiles, como los cambios de pH local en tejidos hipóxicos o asociados a tumores, podría tener implicaciones para la regulación génica, el control epigenético (vía susceptibilidad a la metilación de la citosina) y la estabilidad del genoma.
• Más Allá de la Competencia: El estudio proporciona evidencia experimental de que los estados "híbridos" de G4/i-motivo representan una clase distinta de estructuras de ADN no canónicas, desafiando la suposición de que las hebras ricas en G y ricas en C deben plegarse en estructuras mutuamente excluyentes.

Los autores mantienen un tono modesto, presentando sus modelos estructurales (por ejemplo, los esquemas específicos de apareamiento C•C⁺) como interpretaciones tentativas consistentes con los datos experimentales en lugar de estructuras definitivas de resolución atómica. Enfatizan que estos comportamientos expanden la comprensión actual de la plasticidad estructural en regiones ricas en G/C sin sobreestimar mecanismos de enfermedad específicos más allá de la asociación conocida de tales repeticiones con procesos regulatorios.