Development and Validation of a Sensitive LC-MS/MS Method for Quantifying N-Nitroso-Ketamine in Ketamine Hydrochloride Injections

Resumen Técnico: Desarrollo y Validación de un Método Sensible de LC-MS/MS para la Cuantificación de N-Nitroso-Ketamina en Inyecciones de Clorhidrato de Ketamina

Planteamiento del Problema
Las impurezas de nitrosaminas son una preocupación crítica de calidad en los productos farmacéuticos debido a su potencial mutagénico y carcinogénico. El reciente escrutinio regulatorio por parte de agencias como la FDA, la EMA y la OMS ha hecho necesaria una evaluación de riesgos rigurosa y estrategias de control para las Impurezas de Sustancias Medicinales Relacionadas con Nitrosaminas (NDSRIs, por sus siglas en inglés). El clorhidrato de ketamina, un anestésico disociativo ampliamente utilizado, contiene un grupo funcional de amina secundaria susceptible a la nitrosación bajo condiciones ácidas en presencia de nitrito, lo que puede dar lugar a la formación de N-nitroso-ketamina (NNK). Si bien el mecanismo de formación se comprende, existe una falta de investigación extensa con respecto al perfil toxicológico específico de la NNK, sus restricciones estructurales respecto a la carcinogenicidad y el desarrollo de métodos analíticos sensibles para cuantificarla a niveles de traza en formulaciones parenterales. Los métodos de detección UV convencionales suelen carecer de la sensibilidad requerida para detectar N-nitrosaminas en los niveles de partes por billón (ppb) exigidos por los límites regulatorios.

Metodología
El estudio empleó un enfoque integrado que combina la evaluación del riesgo toxicológico con el desarrollo y la validación de un método analítico ultra sensible.

• Evaluación Toxicológica (CPCA): La potencia carcinogénica de la NNK se evaluó utilizando el Enfoque de Categorización de Potencia Carcinogénica (CPCA) alineado con la FDA. Esta evaluación consideró factores estructurales incluyendo la disponibilidad de hidrógeno $\alpha$, el impedimento estérico y el potencial de activación metabólica. El análisis se centró en si la estructura de la NNK permite la $\alpha$-hidroxilación mediada por el citocromo P450, un requisito previo para la formación de intermediarios reactivos al ADN.
• Desarrollo del Método Analítico: Se desarrolló un método de Cromatografía de Líquidos con Espectrometría de Masas en Tándem (LC-MS/MS).
  • Cromatografía: La separación se logró en una columna Acquity HSS T3 (2.5 µm, 4.6 × 100 mm) a 40 °C utilizando un gradiente de ácido fórmico al 0.1% en agua (Fase Móvil A) y ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo (Fase Móvil B).
  • Detección: Se utilizó la Ionización por Electrospray (ESI) en modo positivo con Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM). La transición específica monitoreada fue el ion precursor $m/z$ 267.0 $\rightarrow$ ion producto $m/z$ 207.0.
  • Desviación de Flujo: Se implementó una estrategia de desviación de flujo temporizada (0.00–0.5 min y 21.5–22.0 min hacia el desecho) para prevenir la contaminación del espectrómetro de masas por la matriz de alta concentración de ketamina.
  • Justificación de MS/MS: Se evaluó la detección por Fotodiodo (PDA), pero fue rechazada debido a la débil absorbancia UV de las N-nitrosaminas y al significativo solapamiento espectral con el API y los componentes de la matriz.
• Validación del Método: El método fue validado de acuerdo con las directrices regulatorias internacionales para especificidad, linealidad, exactitud, precisión (repetibilidad e intermedia), sensibilidad (LOD/LOQ), robustez y estabilidad de la solución.
• Pruebas de Estrés de la Formulación: El estudio incluyó pruebas de estrés de la formulación bajo altas temperaturas (60 °C durante 30 días) y la evaluación de la calidad de las materias primas (específicamente los niveles de nitrito) para evaluar el riesgo de formación de NNK.

Contribuciones Clave y Resultados

1. Clasificación Toxicológica: El análisis estructural reveló que, si bien la NNK posee hidrógenos $\alpha$, el voluminoso esqueleto de ciclohexanona crea un impedimento estérico significativo alrededor del carbono $\alpha$. Esta protección estérica limita la accesibilidad enzimática para la $\alpha$-hidroxilación, reduciendo así la formación de intermediarios reactivos al ADN. Consecuentemente, la NNK fue clasificada como Categoría 5 de CPCA, el nivel más bajo de preocupación carcinogénica, estableciendo un límite de Ingesta Aceptable (AI) de 1500 ng/día. Basado en la dosis diaria máxima de ketamina (1074 mg), esto se traduce en un límite de especificación de aproximadamente 1397 ppb (1.4 ng/mg).
2. Desempeño Analítico: El método LC-MS/MS desarrollado demostró alta sensibilidad y selectividad:
   • Linealidad: Se observó una excelente linealidad desde el Límite de Cuantificación (LOQ) hasta el 200% del límite de especificación (139 ppb a 2779 ppb) con un coeficiente de correlación ($r$) > 0.999.
   • Sensibilidad: El Límite de Detección (LOD) se determinó en 69.5 ppb (S/N > 3), y el Límite de Cuantificación (LOQ) fue de 139.0 ppb (S/N > 10).
   • Exactitud y Precisión: Las tasas de recuperación oscilaron entre el 95% y el 104% en los niveles de LOQ, 100% y 200%. La precisión (RSD) se mantuvo consistentemente dentro del 5.0% para la idoneidad del sistema y la precisión del método, y del 2.0% para la precisión intermedia.
   • Robustez: El método se mantuvo robusto frente a variaciones en el flujo ($\pm$0.2 mL/min) y la temperatura de MS ($\pm$20 °C).
3. Mitigación del Riesgo de la Formulación: Las pruebas de estrés y el análisis de lotes de inyecciones de clorhidrato de ketamina (pH 3.5–5.5) no mostraron una formación significativa de NNK incluso bajo condiciones térmicas aceleradas. Tres lotes comerciales analizados mostraron consistentemente niveles de NNK por debajo del LOQ (139 ppb), confirmando que el proceso de fabricación actual y los controles de materia prima mitigan eficazmente la formación de nitrosaminas.

Significancia
El artículo presenta un marco integral para la gestión de las NDSRIs en formulaciones basadas en ketamina. Al combinar una evaluación toxicológica guiada por la estructura con un método analítico ultra sensible y validado, el estudio proporciona una estrategia científicamente sustentada para el cumplimiento regulatorio. La investigación destaca que las restricciones estructurales (impedimento estérico) pueden reducir significativamente la potencia carcinogénica de ciertas NDSRIs, justificando límites de ingesta aceptable más altos en comparación con las nitrosaminas de bajo peso molecular. Además, el desarrollo exitoso de un método LC-MS/MS capaz de cuantificar NNK en niveles de sub-ppb aborda una brecha crítica en el monitoreo analítico de formulaciones parenterales, ofreciendo un paradigma replicable para la evaluación de riesgos y el control en otros productos farmacéuticos que contienen aminas secundarias.