ISGylation of STING contributes to neuroinflammation and neurodegeneration via activating c-Fos in Parkinson's disease models

Resumen Técnico: La ISGilación de STING contribuye a la neuroinflamación y la neurodegeneración mediante la activación de c-Fos en modelos de la enfermedad de Parkinson

Planteamiento del problema
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo progresivo caracterizado por la pérdida de neuronas dopaminérgicas (ND) en la sustancia negra pars compacta (SNc) y la formación de cuerpos de Lewy. Si bien la agregación de $\alpha$-sinucleína mal plegada y la disfunción mitocondrial son factores bien establecidos, el papel de la neuroinflamación crónica y la respuesta inmunitaria innata sigue siendo un área crítica de investigación. Específicamente, los interferones (IFN) de Tipo I y sus genes estimulados por interferón (ISG) descendientes han sido implicados en la neurodegeneración; sin embargo, los mecanismos precisos por los cuales la modificación de proteínas mediada por ISG15 (ISGilación) influye en la patogénesis de la EP aún no se comprenden completamente. Este estudio aborda la laguna de conocimiento sobre si la vía IFN-ISG15 contribuye a la EP mediante la ISGilación del sensor de ADN STING (Stimulator of Interferon Genes), impulsando así la neuroinflamación y la muerte neuronal.

Metodología
El estudio empleó un enfoque integral combinando modelos in vitro e in vivo para investigar el eje STING-ISG15-c-Fos:

• Modelos in vitro: Se utilizaron células de neuroblastoma humano SH-SY5Y tratadas con MPP+ (una neurotoxina) o infectadas con vectores lentivirales que expresan la $\alpha$-sinucleína humana A53T (PLV-SynA53T) para imitar la patología de la EP.

  • Manipulación genética: Las células fueron infectadas con lentivirus que codifican STING de tipo salvaje (STING-WT), un mutante no ISGilable (STING-K289A), o shRNA dirigido contra ISG15 (shISG15).
  • Intervención farmacológica: Se utilizó el inhibidor de STING C-176 para bloquear la actividad de STING.
  • Ensayos: Se emplearon Western blotting, Co-Inmunoprecipitación (Co-IP) y secuenciación de ARN (transcriptómica) para analizar las interacciones proteicas, el estado de la ISGilación y la expresión génica. La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos CCK-8.

• Modelos in vivo: Se utilizaron dos modelos de EP distintos:

  1. Modelo MPTP: Ratones C57BL/6J recibieron inyecciones intraperitoneales de MPTP.
  2. Modelo AAV: Ratones recibieron inyecciones estereotáxicas bilaterales de AAV2/1-SynA53T en la SNc.
  • Intervenciones: Los ratones fueron pretratados con vectores lentivirales (STING-WT, STING-K289A, shISG15) o el inhibidor de STING C-176 antes o durante la inducción de la EP.
  • Pruebas de comportamiento: Se realizaron pruebas de campo abierto, pruebas de Rotarod y pruebas de polo para evaluar la función motora y la coordinación.
  • Histología y análisis molecular: Se realizaron inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) en secciones de la SNc para cuantificar neuronas dopaminérgicas (positivas para TH), activación glial (GFAP, Iba1) y co-localización de proteínas (STING, c-Fos). El Western blotting se utilizó para cuantificar los niveles de ISG15, ISG-STING, c-Fos, NF-$\kappa$B y TNF-$\alpha$.

Contribuciones clave y resultados

1. Inducción de ISG15 e ISG-STING en modelos de EP:
   El estudio demostró que tanto la expresión de ISG15 como la ISGilación de STING (ISG-STING) estaban significativamente aumentadas en los modelos de EP in vitro (MPP+ y SynA53T) e in vivo (MPTP y AAV-SynA53T). La Co-IP confirmó que ISG15 se une covalentemente a STING, formando un complejo con un peso molecular de aproximadamente 52 kDa (suma de ISG15 ~15 kDa e ISG-STING ~37 kDa).

2. Identificación de K289 como el sitio de ISGilación:
   El análisis transcriptómico de la sobreexpresión de STING-WT reveló la regulación al alza de genes tempranos inmediatos (IEG), notablemente c-Fos. El estudio identificó la lisina 289 (K289) como el sitio crítico para la ISGilación. El mutante STING-K289A, que no puede ser ISGilado, no logró inducir niveles altos de c-Fos, NF-$\kappa$B o TNF-$\alpha$, y no promovió la muerte celular en la misma medida que STING-WT.

3. El eje STING-c-Fos impulsa la neuroinflamación y la muerte celular:

   • Mecanismo: La ISGilación de STING actúa como una modificación de "ganancia de función", aumentando la actividad de STING. Esto conduce a la regulación al alza de c-Fos, un componente del complejo del factor de transcripción AP-1.
   • Efectos descendentes: La activación del eje STING-c-Fos resultó en un aumento de la expresión de mediadores inflamatorios (NF-$\kappa$B, TNF-$\alpha$) y la subsiguiente muerte de neuronas dopaminérgicas.
   • Bucle de retroalimentación positiva: El estudio propone un mecanismo de retroalimentación positiva donde la activación de STING induce el IFN y el ISG15 descendientes, que a su vez ISGilan más a STING, potenciando el proceso neurodegenerativo.

4. Las intervenciones terapéuticas revirtieron la patología:

   • Reducción genética/Modificación: Tanto en los ratones MPTP como en los AAV-SynA53T, la expresión de STING-K289A o la reducción de ISG15 (shISG15) redujo significativamente los niveles de ISG-STING, la expresión de c-Fos y la neuroinflamación.
   • Bloqueo farmacológico: El tratamiento con el inhibidor de STING C-176 produjo efectos protectores similares.
   • Recuperación funcional: Estas intervenciones restauraron el recuento de neuronas dopaminérgicas (células positivas para TH), redujeron la activación glial (GFAP e Iba1) y mejoraron significativamente los comportamientos motores (distancia recorrida, tiempo de retención de rotación y tiempo de escalada en el polo) en comparación con los grupos de control.

5. Localización celular:
   El análisis de inmunofluorescencia reveló que en los modelos de EP, STING y c-Fos son inducidos predominantemente y se co-localizan dentro de las neuronas (positivas para NeuN), en lugar de únicamente en las células gliales, lo que sugiere un papel autónomo celular de STING neuronal en el impulso de la patología de la EP.

Significancia y afirmaciones
El artículo afirma establecer un nuevo vínculo mecánico entre la vía inmunitaria innata ISG15 y la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Específicamente, postula que:

• La ISGilación de STING en el residuo K289 es un impulsor crítico de la neuroinflamación y la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la EP.
• Esta modificación potencia la función de STING (ganancia de función), lo que conduce a la activación de c-Fos y un bucle de retroalimentación positiva posterior que involucra al IFN e ISG15 que exacerba la neurodegeneración.
• Dirigirse al proceso de ISGilación mediado por ISG15 o la interacción entre ISG15 y STING representa una potencial y nueva estrategia terapéutica para la EP.

El estudio concluye que la interrupción del eje ISG-STING-c-Fos puede mejorar los déficits motores y la muerte neuronal en modelos de EP, ofreciendo una nueva perspectiva para tratar enfermedades neurodegenerativas mediante la modulación de modificaciones postraduccionales específicas de los sensores inmunitarios.