Reversible covalency reprograms CRBN substrate recruitment and PROTAC-mediated degradation

Resumen Técnico: La covalencia reversible reprograma el reclutamiento de sustratos de CRBN y la degradación mediada por PROTAC

Planteamiento del problema
La degradación de proteínas dirigidas (TPD) mediante PROTACs y pegamentos moleculares (molecular glues) ha validado la degradación de proteínas previamente "indrogables". Si bien los ligandos covalentes que actúan sobre las E3 ubiquitina ligasas (como CRBN) pueden mejorar la estabilidad del complejo ternario y la eficiencia de la degradación, la modificación covalente irreversible presenta desafíos relacionados con la selectividad, la toxicidad y la pérdida de la rotación catalítica (turnover). Por el contrario, los ligandos no covalentes pueden carecer del tiempo de residencia suficiente. Existe la necesidad de estrategias que combinen la alta potencia de la unión covalente con la reversibilidad requerida para la farmacología catalítica, específicamente para modular el panorama de reclutamiento de sustratos de la E3 ligasa Cereblon (CRBN).

Metodología
Los autores emplearon un enfoque multidisciplinar que combina el diseño químico guiado por estructura, biología estructural, ensayos bioquímicos, perfilado de degradación celular y proteómica global:

• Diseño Químico: Se sintetizó una biblioteca de derivados de IMiD basados en ácido borónico (Bo-IMiDs) y sus correspondientes PROTACs (Bo-TACs). Estos compuestos presentan grupos pinacolboronato (BPin) o ácido borónico (Bo) posicionados para interactuar con el residuo sensor de CRBN, His353.
• Biología Estructural: Se utilizó cristalografía de rayos X para resolver estructuras binarias (CRBN-ligando) y ternarias (CRBN-ligando-PROTAC-sustrato). La espectrometría de masas de movilidad iónica nativa (IM-MS) y la disociación inducida por colisión (CID) se utilizaron para evaluar la estabilidad del complejo.
• Ensayos Bioquímicos y Celulares: Los ensayos de polarización de fluorescencia (FP) y NanoBRET midieron la afinidad de unión y el compromiso del objetivo celular. Los experimentos de lavado (washout) distinguieron entre mecanismos covalentes reversibles e irreversibles. La eficacia de la degradación se cuantificó mediante ensayos de reportero HiBiT para BRD4, IKZF1 y SALL4.
• Proteómica: Se realizaron proteómica global (HiBiT y espectrometría de masas) y quimioproteómica (ProxiCapture) en células MOLT-4 para mapear el interactoma y el degradoma de CRBN, comparando Bo-IMiDs/Bo-TACs contra IMiDs canónicos (p. ej., pomalidomida) y controles no covalentes.
• Modelado Matemático: La formación del complejo ternario y la cinética de degradación se modelaron para analizar el "efecto gancho" (hook effect) y la cooperatividad.

Contribuciones Clave y Resultados

1. Descubrimiento del acoplamiento covalente reversible de CRBN:
   El estudio identificó que los IMiDs modificados con ácido borónico (Bo-IMiDs) se acoplan a CRBN mediante una interacción covalente reversible con la cadena lateral de imidazol de His353. Las estructuras cristalinas (resolución de 1.7–2.2 Å) revelaron la formación de un aducto de boronato tetraédrico entre el centro de boro y el nitrógeno $\epsilon$ de His3353. Esta interacción aumenta la potencia de unión (una mejora de 6 a 18 veces en la IC50) en comparación con los controles no covalentes o modificados con bromo, manteniendo la reversibilidad confirmada por la espectrometría de masas CID (estabilidad intermedia entre los uniones no covalentes e irreversibles).

2. Reprogramación de la actividad de pegamento molecular:
   Los IMiDs canónicos (p. ej., talidomida, lenalidomida) actúan como pegamentos moleculares reclutando neo-sustratos (IKZF1, GSPT1, SALL4) a través de un degrón de bucle G (G-loop). Los autores demostraron que los Bo-IMiDs abogan completamente la degradación de estos sustratos canónicos del bucle G. El superposición estructural sugiere que el bloqueo covalente de His353 en un rotámero alternativo genera un choque estérico con el sitio de unión del bucle G, remodelando eficazmente el interactoma de CRBN para excluir a los sustratos canónicos del pegamento molecular.

3. Mejora de la eficacia de los PROTACs y expansión de la ventana terapéutica:
   La incorporación de Bo-IMiDs en PROTACs dirigidos a BRD4 (Bo-TACs) resultó en una degradación profunda y eficaz.

• Selectividad: Los Bo-TACs retuvieron un alto reclutamiento de BRD4, pero suprimieron el reclutamiento de sustratos canónicos del pegamento molecular (IKZF1, IKZF2, etc.), mejorando la selectividad del degradador.
• Mitigación del Efecto Gancho: A pesar de exhibir una cooperatividad negativa en la formación del complejo ternario, los Bo-TACs mostraron un inicio retrasado del "efecto gancho" (inhibición de la degradación a concentraciones altas). El modelado matemático y las curvas de degradación mostraron que los Bo-TACs mantuvieron >99% de degradación a través de un rango de concentración más amplio en comparación con los PROTACs no modificados o covalentes irreversibles.
• Estabilidad del Complejo Ternario: Los ensayos de TR-FRET indicaron que los Bo-TACs forman complejos ternarios más estables con señales FRET máximas más altas, lo que sugiere una mejor estabilidad conformacional.

4. Base estructural para una degradación mejorada:
   La estructura cristalina del complejo ternario (CRBN:Bo-TAC:BRD4) reveló que la fracción de ácido borónico actúa como un centro de interacción "camaleónico". Más allá de unirse covalentemente a His353, los grupos hidroxilo del ácido borónico forman enlaces de hidrógeno con el sustrato BRD4 (específicamente Gly143 y Asp145). Esto crea una nueva red de interacciones que involucra contactos proteína-proteína adicionales (p. ej., BRD4 Trp81 con CRBN His103) que no se observaron en las estructuras de PROTACs no covalentes previas, lo que probablemente contribuye a la mayor eficiencia de la degradación.

5. Extensión a andamiajes mínimos:
   La estrategia se aplicó con éxito a andamiajes de ligandos mínimos de CRBN (fenil-glutarimida y fenil-dihidrouracilo). La sustitución de boro en posiciones específicas (la posición 4 del anillo de fenilo) mejoró significamente la afinidad (pasando de un rango de $\mu$M a nM) preservando propiedades fisicoquímicas favorables (solubilidad, estabilidad metabólica y bajo peso molecular), demostrando la generalizabilidad de este enfoque para la optimización de ligandos.

Significado
Este artículo establece que el direccionamiento covalente reversible de CRBN vía His353 es una estrategia viable para modular la función de la E3 ligasa. Al combinar la potencia de la unión covalente con la controlabilidad de las interacciones reversibles, este enfoque:

• Desacopla el alto compromiso de la E3 de la afiliación de sustratos canónicos del pegamento molecular, permitiendo el diseño de PROTACs altamente selectivos.
• Expande el espacio químico de la degradación de proteínas dirigidas al introducir la química del boro como un farmacóforo versátil que puede comprometer simultáneamente a la E3 ligasa y al sustrato.
• Mejora la ventana terapéutica de los PROTACs al mitigar el efecto gancho, permitiendo una degradación profunda a través de un rango de concentración más amplio.
• Proporciona un modelo para desarrollar ligandos mínimos, con características de fármaco, con afinidad mejorada mediante química covalente reversible.

Los autores conclizan que esta modalidad ofrece una nueva faceta de la utilidad de los boronatos en el descubrimiento de fármacos, permitiendo un compromiso de diana dinámico y la formación de nuevas redes de interacción que mejoran la productividad de la degradación.