The insertion of Neomycin cassette impairs maternal and social behaviors in Arc/Arg3.1 knock-out mice

Resumen Técnico: El impacto del casete de Neomicina en los fenotipos conductuales en ratones con deleción de Arc/Arg3.1

Planteamiento del problema
El gen Arc/Arg3.1 (proteína asociada al citoesqueleto regulada por actividad) es un regulador crítico de la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria. Su desregulación está vinculada a trastornos del neurodesarrollo y psiquiátricos, incluyendo la esquizofrenia y el trastorno del espectro autista (TEA). Sin embargo, estudios previos que utilizaron modelos de ratón con deleción (KO) de Arc/Arg3.1 han arrojado resultados inconsistentes con respecto a las conductas sociales. Un estudio utilizando la línea KO1 (que porta un casete de resistencia a la neomicina, Neo+) reportó una reducción en la sociabilidad, mientras que otro utilizando la línea KO2 (que carece del casete Neo) no encontró tales déficits. El problema central abordado en este estudio es si estas discrepancias surgen de la deleción del propio Arc/Arg3.1 o de la presencia del casete Neo, un marcador de selección común utilizado en la generación de modelos knockout.

Metodología
Los investigadores emplearon un enfoque comparativo utilizando tres líneas distintas de ratones para aislar los efectos del casete Neo:

1. Neo+ KO1: La línea original de KO de Arc/Arg3.1 que contiene el casete Neo (fondo genético mixto C57BL/6J–129S2).
2. Neo− KO1: La misma línea KO1 con el casete Neo extirpado mediante recombinación Cre-loxP, conservando el resto de la arquitectura genómica.
3. Neo− KO2: Una línea de KO de Arc/Arg3.1 separada que carece del casete Neo (fondo C57BL/6J).

Evaluaciones conductuales:

• Conducta materna: Se realizaron pruebas de recuperación de crías y de construcción de nidos en hembras primíparas.
• Conducta social: La sociabilidad se midió mediante el test de tres cámaras y el Rastreador de Ratones Vivos (LMT) para interacciones con congéneres familiares y desconocidos. La memoria social se evaluó mediante pruebas de reconocimiento social.
• Comunicación: Se registraron las vocalizaciones ultrasónicas (USVs) en crías tras la separación materna.
• Olfato: Se realizaron pruebas de habituación-deshabituación con olores neutros, de comida y sociales.
• Conductas no sociales: Se evaluaron la ansiedad, la memoria espacial, la coordinación motora y las conductas repetitivas (acicalamiento excesivo) de tipo auto-grooming.

Análisis moleculares y celulares:

• Expresión génica: Se realizaron PCR cuantitativa (qPCR) y secuenciación de ARN masivo (RNA-seq) en el núcleo paraventricular (PVN), la corteza prefrontal (PFC), el núcleo accumbens (NAC) y otras regiones.
• Análisis de proteínas: El Western blot evaluó los niveles de Arc, el producto proteico de Neo (aminofosfotransferasa de aminoglucósidos) y las vías de señalización de ERK1/2.
• Inmunohistoquímica: Se examinó la localización de las neuronas de oxitocina (OT) y del producto proteico de Neo.
• Intervención: Se realizaron administraciones crónicas intranasales de oxitocina y experimentos de enriquecimiento social temprano en la vida para probar la reversibilidad de los déficits.

Resultados clave

1. Los déficits maternos y sociales dependen de Neo:

   • Conducta materna: El 93% de las hembras Neo+ KO1 fallaron en la recuperación de sus crías, mostrando un deterioro significativo en el cuidado materno. En contraste, las hembras Neo− KO1 y Neo− KO2 mostraron una conducta materna normal, indistinguible de los controles de tipo silvestre (WT).
   • Interacción social: Los ratones Neo+ KO1 exhibieron una reducción en la interacción social y la motivación con congéneres tanto familiares como desconocidos. Los ratones Neo− KO1 no mostraron estos déficits; notablemente, los machos Neo− KO1 mostraron un aumento en la interacción social en comparación con el WT, un fenotipo que estaba enmascarado en la línea Neo+.
   • Comunicación de las crías: Las crías Neo+ KO1 exhibieron USVs retrasadas y reducidas, lo que indica una comunicación social deteriorada.

2. Mecanismos moleculares en el PVN:

   • Expresión de la proteína Neo: El producto proteico del casete Neo se detectó específicamente en el PVN de los ratones Neo+ KO1, pero no en otras regiones cerebrales ni en los ratones Neo−.
   • Desregulación del sistema de oxitocina: Aunque el número de neuronas de oxitocina era normal, la densidad de las fibras en el NAC y la PFC se redujo en los ratones Neo+ KO1. El RNA-seq reveló una desregulación del receptor de oxitocina (Oxtr) y otros genes asociados con la síntesis de proteínas y la adhesión celular.
   • Señalización de ERK: La presencia del casete Neo condujo a un aumento en la fosforilación de ERK1/2 en el PVN de las hembras Neo+ KO1. Esto sugiere que la proteína Neo, estructuralmente similar a las quinasas eucariotas, puede activar de forma aberrante la vía ERK.
   • Expresión génica: El RNA-seq identificó una regulación a la baja específica de genes relacionados con la síntesis de proteínas y una regulación al alza de genes relacionados con el estrés en el PVN de los ratones Neo+ KO1. No se encontraron cambios significativos en los genes inmediatamente adyacentes al locus Arc/Arg3.1, lo que sugiere que los efectos no se deben a efectos de posición local sobre genes vecinos.

3. Resultados de la intervención:

   • Tratamiento con oxitocina: La administración crónica de oxitocina intranasal no logró rescatar los déficits sociales en los ratones Neo+ KO1, a pesar de ser efectiva en los ratones WT. Esto sugiere que el mecanismo subyacente implica una desregulación de la señalización sostenida que no puede ser superada mediante la administración de oxitocina exógena.
   • Enriquecimiento social: El enriquecimiento social temprano en la vida mejoró parcialmente la sociabilidad en los ratones Neo+ KO1 cuando interactuaban con compañeros de jaula familiares, pero no restauró la respuesta ante animales desconocidos ni rescató los déficits de conducta materna.

Significancia y afirmaciones
Los autores concluyen que la inserción del casete de resistencia a la neomicina, más que la deleción de Arc/Arg3.1 por sí sola, es la responsable de los graves deterioros conductuales maternos y sociales observados en la línea KO1 Neo+. El estudio demuestra que el casete Neo ejerce efectos "fuera de objetivo" (off-target), incluyendo:

• La inducción de fenotipos conductuales específicos (p. ej., negligencia materna, retraimiento social).
• El enmascaramiento de otros fenotipos (p. ej., el aumento de la interacción social en machos Neo−).
• La alteración de las vías de señalización celular (vía ERK) y los perfiles de expresión génica, particularmente dentro del sistema de oxitocina del PVN.

El artículo sostiene que estos hallazgos requieren una reevaluación cuidadosa de las conclusiones extraídas de los modelos animales que retienen el casete Neo, particularmente en la investigación neurocientífica referente a conductas sociales y maternas. Los autores destacan que el casete Neo puede contribuir a la variabilidad fenotípica en otros modelos KO (p. ej., Shank3, Fmr1, Cntnap2) y podría conducir a interpretaciones erróneas de la función génica en estudios preclínicos. El estudio aboga por el uso de líneas Neo− o estrategias de genotipado alternativas para asegurar la validez de los fenotipos conductuales en los modelos de deleción.