Genomic Copy Number Variation Profiling of Pleural Effusion cfDNA via LP-WGS for Precision Diagnosis and Prognostic Stratification in Lung Adenocarcinoma-associated Malignant Pleural Effusion running title: cfDNA CNV for LUAD-MPE Diagnosis and Prognosis

Resumen Técnico: Perfil de Variación del Número de Copias Genómicas mediante LP-WGS en cfDNA de Efusión Pleural para LUAD-MPE

Planteamiento del Problema
El derrame pleural maligno (MPE) asociado al adenocarcinoma de pulmón (LUAD) es una característica distintiva de la enfermedad avanzada con una mediana de supervivencia de solo 3 a 12 meses. Las estrategias diagnósticas actuales enfrentan limitaciones críticas: el examen citológico del líquido pleural sufre de una sensibilidad variable (40–87%) debido al bajo recuento de células malignas y una distribución desigual; las biopsias invasivas (por ejemplo, toracoscopia) no siempre son toleradas; y los biomarcadores tradicionales como el antígeno carcinoembrionario (CEA) carecen de la precisión suficiente. Además, existe una escasez de biomarcadores pronósticos validados para la estratificación de riesgo clínico en MPE. Existe una necesidad urgente de herramientas no invasivas y de alta sensibilidad que faciliten el diagnóstico temprano, el monitoreo dinámico y el manejo personalizado.

Metodología
El estudio empleó un diseño de cohorte prospectivo que involucró a 41 pacientes (30 con LUAD asociado a MPE confirmado y 11 con efusiones pleurales benignas [BPE]) tratados en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Nanchang.

• Procesamiento de Muestras: Se recolectó 50 mL de fluido de efusión pleural, se centrifugó y se aisló el ADN libre de células (cfDNA) del sobrenadante.
• Secuenciación: Se realizó una secuenciación de genoma completo de bajo paso (LP-WGS) en las librerías de cfDNA. La profundidad de secuenciación promedio fue de 2.4× (rango 1.5×–4.3×), utilizando lecturas de extremos emparejados (paired-end) de 150 pb en la plataforma HiSeq X10.
• Análisis Bioinformático: Se utilizó un flujo de trabajo personalizado, el detector de aneuploidía cromosómica ultrasensible (UCAD), para el perfilado de la Variación del Número de Copias (CNV). Esto implicó el cálculo de la profundidad de secuenciación de base única, la normalización de la cobertura mediante puntuaciones Z en bins genómicos de 200 kb, y la aplicación de segmentación binaria circular (paquete DNAcopy) para identificar segmentos genómicos continuos.
• Métricas: El estudio calculó la Fracción Tumoral (TF) utilizando un modelo oculto de Markov y evaluó el |Z score| a escala genómica como un sustituto de la inestabilidad genómica.
• Análisis Estadístico: El rendimiento diagnóstico se evaluó mediante curvas ROC y AUC. Las correlaciones entre las características genómicas y las variables clinicopatológicas (incluyendo la proporción de células tumorales citológicas y el estado de diferenciación) se evaluaron mediante la correlación de Spearman. El análisis de supervivencia se realizó mediante curvas de Kaplan–Meier y pruebas de log-rank.

Contribuciones Clave y Resultados

1. Superioridad Diagnóstica: Se detectaron CNVs en el 96.7% de los pacientes con MPE en comparación con solo el 9.1% de los controles benignos (P < 0.001). Un modelo diagnóstico integrado basado en CNV, que utiliza |Z scores| a escala genómica con un punto de corte de ≥ 3.835, alcanzó un Área Bajo la Curva (AUC) de 0.939 (IC 95% 0.855–0.999), con una sensibilidad del 96.7% y una especificidad del 90.9%. Este modelo superó la prueba de CEA tradicional (AUC = 0.888) e identificó con éxito cuatro casos de MPE que eran negativos para CEA.
2. Paisajes Genómicos Distintos: Las muestras de MPE exhibieron amplificaciones focales recurrentes y deleciones amplias ausentes en las muestras benignas. Las amplificaciones notables incluyeron 1q, 5p, 7p, 8q y 17q (que albergan oncogenes como MCL1, MDM4, EGFR, MYC y ERBB2). Se observaron deleciones significativas en 3p, 6q, 8p, 9p, 9q, 10q, 11p, 12q, 13q, 15q, 17p y 18q (que albergan supresores de tumores como CDKN2A, PTCH1, PTEN, RB1 y TP53). El estudio identificó desequilibrios sincrónicos a nivel de brazo (por ejemplo, deleción de 1p/amplificación de 1q y deleción de 17p/amplificación de 17q) y correlaciones específicas entre eventos cromosómicos (por ejemplo, correlación positiva entre las amplificaciones de 7p y 17q).
3. Correlación con la Carga Tumoral y la Agresividad: La fracción tumoral (TF) y el |Z score| genómico mostraron fuertes correlaciones positivas con las proporciones de células tumorales citológicas (R = 0.67 y R = 0.70, respectivamente; P < 0.0001). Los tumores pobremente diferenciados exhibieron una inestabilidad genómica significativamente mayor (mayores medianas de |Z scores|) en comparación con los tumores moderadamente diferenciados (P = 0.032).
4. Estratificación Pronóstica: El análisis de supervivencia de 24 pacientes con MPE con datos de seguimiento reveló que alteraciones de CNV específicas se asociaron con una menor supervivencia global (OS). La amplificación de 18p y las deleciones de 8p, 9q y 19q se correlacionaron significativamente con un mal pronóstico (P < 0.05).

Significancia y Reivindicaciones
Los autores afirman que el análisis de CNV basado en LP-WGS de cfDNA de efusión pleural es una herramienta costo-efectiva (aproximadamente $200 por muestra) y no invasiva que aborda las limitaciones de sensibilidad de la citología y las restricciones de precisión del CEA. Al sintetizar las señales globales de CNV a través de 22 cromosomas, el método proporciona un perfil robusto capaz de distinguir MPE de efusiones benignas, incluso en casos negativos para CEA.

El estudio posiciona este enfoque como una prueba complementaria a la citología y al CEA, particularmente para pacientes que no pueden someterse a una biopsia invasiva. Además, afirma su utilidad en la estratificación pronóstica, donde patrones específicos de CNV (amplificación de 18p, deleciones de 8p/9q/19q) y métricas como la TF y el |Z score| pueden reflejar la carga tumoral, el estado de diferenciación y predecir los resultados de supervivencia. Los autores concluyen que este método facilita el diagnóstico temprano y el manejo personalizado de la MPE asociada a LUAD avanzada, aunque reconocen la necesidad de una validación multicéntrica para confirmar su generalizabilidad.