Genomic Copy Number Variation Profiling of Pleural Effusion cfDNA via LP-WGS for Precision Diagnosis and Prognostic Stratification in Lung Adenocarcinoma-associated Malignant Pleural Effusion running title: cfDNA CNV for LUAD-MPE Diagnosis and Prognosis

Resumo Técnico: Perfil de Variação do Número de Cópias Genômicas de cfDNA de Efusão Pleural via LP-WGS para LUAD-MPE

Declaração do Problema
O adenocarcinoma de pulmão (LUAD) associado à efusão pleural maligna (MPE) é uma característica de doença avançada com uma sobrevida mediana de apenas 3 a 12 meses. As estratégias diagnósticas atuais enfrentam limitações críticas: o exame citológico do fluido pleural sofre de sensibilidade variável (40–87%) devido à baixa contagem de células malignas e distribuição desigual; biópsias invasivas (ex: toracoscopia) nem sempre são toleradas; e biomarcadores tradicionais como o antígeno carcinoembrionário (CEA) carecem de precisão suficiente. Além disso, há uma escassez de biomarcadores prognósticos validados para estratificação de risco clínico em MPE. Existe uma necessidade urgente de ferramentas não invasivas e de alta sensibilidade para facilitar o diagnóstico precoce, o monitoramento dinâmico e o manejo personalizado.

Metodologia
O estudo empregou um desenho de coorte prospectiva envolvendo 41 pacientes (30 com MPE confirmada associada ao LUAD e 11 com efusões pleurais benignas [BPE]) tratados no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Nanchang.

• Processamento de Amostras: O fluido de efusão pleural (50 mL) foi coletado, centrifugado, e o DNA livre de células (cfDNA) foi isolado do sobrenadante.
• Sequenciamento: O sequenciamento de genoma completo de baixa cobertura (LP-WGS) foi realizado nas bibliotecas de cfDNA. A profundidade média de sequenciamento foi de 2,4× (intervalo de 1,5×–4,3×), utilizando leituras pareadas de 150 pb na plataforma HiSeq X10.
• Análise Bioinformática: Um fluxo de trabalho customizado, o detector de aneuploidia cromossômica ultrassensível (UCAD), foi utilizado para o perfil de Variação do Número de Cópias (CNV). Isso envolveu o cálculo da profundidade de sequenciamento de base única, a normalização da cobertura para escores Z em bins genômicos de 200 kb, e a aplicação de segmentação binária circular (pacote DNAcopy) para identificar segmentos genômicos contínuos.
• Métricas: O estudo calculou a Fração Tumoral (TF) usando um modelo oculto de Markov e avaliou o |Z score| em todo o genoma como um substituto para a instabilidade genômica.
• Análise Estatística: O desempenho diagnóstico foi avaliado via curvas ROC e AUC. Correlações entre características genômicas e variáveis clinicopatológicas (incluindo proporção de células tumorais citológicas e status de diferenciação) foram avaliadas usando a correlação de Spearman. A análise de sobrevivência foi conduzida por meio de curvas de Kaplan–Meier e testes de log-rank.

Principais Contribuições e Resultados

1. Superioridade Diagnóstica: CNVs foram detectadas em 96,7% dos pacientes com MPE comparado a apenas 9,1% dos controles benignos (P < 0,001). Um modelo diagnóstico integrado baseado em CNV, utilizando |Z scores| em todo o genoma com um ponto de corte de ≥ 3,835, alcançou uma Área Sob a Curva (AUC) de 0,939 (95% CI 0,855–0,999), com 96,7% de sensibilidade e 90,9% de especificidade. Este modelo superou o teste de CEA tradicional (AUC = 0,888) e identificou com sucesso quatro casos de MPE que eram negativos para CEA.
2. Paisagens Genômicas Distintas: As amostras de MPE exibiram amplificações focais recorrentes e deleções amplas ausentes em amostras benignas. Amplificações notáveis incluíram 1q, 5p, 7p, 8q e 17q (abrigando oncogenes como MCL1, MDM4, EGFR, MYC e ERBB2). Deleções significativas foram observadas em 3p, 6q, 8p, 9p, 9q, 10q, 11p, 12q, 13q, 15q, 17p e 18q (abrigando supressores de tumor como CDKN2A, PTCH1, PTEN, RB1 e TP53). O estudo identificou desequilíbrios de nível de braço síncronos (ex: deleção de 1p/amplificação de 1q e deleção de 17p/amplificação de 17q) e correlações específicas entre eventos cromossômicos (ex: correlação positiva entre as amplificações de 7p e 17q).
3. Correlação com Carga Tumoral e Agressividade: A fração tumoral (TF) e o |Z score| em todo o genoma mostraram fortes correlações positivas com as proporções de células tumorais citológicas (R = 0,67 e R = 0,70, respectivamente; P < 0,0001). Tumores pouco diferenciados exibiram instabilidade genômica significativamente maior (|Z scores| medianos mais altos) em comparação com tumores moderadamente diferenciados (P = 0,032).
4. Estratificação Prognóstica: A análise de sobrevivência de 24 pacientes com MPE com dados de acompanhamento revelou que alterações específicas de CNV foram associadas a uma menor sobrevida global (OS). A amplificação de 18p e as deleções de 8p, 9q e 19q foram significativamente correlacionadas com um mau prognóstico (P < 0,05).

Significância e Alegações
Os autores alegam que a análise de CNV baseada em LP-WGS de cfDNA de efusão pleural é uma ferramenta de baixo custo (aproximadamente US$ 200 por amostra) e não invasiva que aborda as limitações de sensibilidade da citologia e as restrições de precisão do CEA. Ao sintetizar sinais globais de CNV através de 22 cromossomos, o método fornece um perfil robusto capaz de distinguir MPE de efusões benignas, mesmo em casos negativos para CEA.

O estudo posiciona esta abordagem como um teste complementar à citologia e ao CEA, particularmente para pacientes incapazes de submeter-se a biópsia invasiva. Alega ainda utilidade na estratificação prognóstica, onde padrões específicos de CNV (amplificação de 18p, deleções de 8p/9q/19q) e métricas como TF e |Z score| podem refletir a carga tumoral, o status de diferenciação e prever resultados de sobrevida. Os autores concluem que este método facilita o diagnóstico precoce e o manejo personalizado de MPE associado ao LUAD avançado, embora reconheçam a necessidade de validação multicêntrica para confirmar a generalizabilidade.