Molecular Markers of Antimalarial Resistance in Children with Uncomplicated Plasmodium falciparum at Two Sites in Liberia in 2022-2023

Resumen Técnico: Marcadores Moleculares de Resistencia Antimalárica en Niños con Plasmodium falciparum No Complicado en Dos Sitios en Liberia (2023-2023)

Planteamiento del Problema
La malaria sigue siendo una causa significativa de morbilidad y mortalidad en Liberia, donde Plasmodium falciparum es la especie predominante. Si bien las Terapias Combinadas basadas en Artemisinina (TCA) son el estándar de atención, la eficacia de estos fármacos se ve amenazada por la emergencia de resistencia a los parásitos. Estudios previos en Liberia indicaron un descenso en la eficacia de la artesunato-amodiaquina (ASAQ), lo que impulsó el cambio a arteméter-lumefantrina (AL) como tratamiento de primera línea. Sin embargo, se requiere un monitoreo continuo para asegurar la efectividad sostenida de las TCA y para detectar señales tempranas de resistencia a los derivados de la artemisinina y a los fármacos complementarios. Este estudio aborda la necesidad de vigilancia molecular para caracterizar la prevalencia de marcadores genéticos validados y candidatos asociados con la resistencia a fármacos antimaláricos en Liberia.

Metodología
Este estudio fue un análisis molecular retrospectivo de muestras recolectadas durante un Estudio de Eficacia Terapéutica (TES) realizado entre agosto de 2022 y julio de 2023 en dos sitios centinela rurales: Saclepea (Condado de Nimba) y Sinje (Condado de Grand Cape Mount).

• Población de Estudio: Se inscribieron 352 niños (de 6 meses a 5 años) con monoinfecciones de P. falciparum no complicadas. Fueron tratados con AL o ASAQ y seguidos durante 28 días.
• Recolección de Muestras: Se recolectaron gotas de sangre seca (DBS) en el Día 0 (D0) y en el Día de la Falla (DoF) para los participantes con parasitemia recurrente.
• Procesamiento de Muestras: De 328 especímenes de DBS recibidos, 255 cumplieron con los criterios de calidad tras excluir 71 muestras con crecimiento visible de moho. El ADN se extrajo de 91 muestras (todas las 10 muestras pareadas D0/DoF y 81 muestras no pareadas de D0 seleccionadas aleatoriamente).
• Análisis Molecular:
  • Confirmación de Especie: Un ensayo de PCR de tiempo real multiplex (PET-PCR) confirmó las monoinfecciones de P. falciparum en 90 muestras.
  • Secuenciación: Se realizó la amplificación de longitud completa de seis genes asociados a la resistencia (Pfk13, Pfmdr1, Pfcrt, Pfdhfr, Pfdhps, Pfcytb) utilizando el protocolo de Secuenciación de Nueva Generación (NGS) de Vigilancia de Resistencia a la Malaria (MaRS).
  • Procesamiento de Datos: La secuenciación se llevó a cabo en una plataforma Illumina MiSeq. Los datos se procesaron utilizando el flujo de trabajo Nf-NeST para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con una puntuación de calidad mínima de 35 y una cobertura de al menos cinco lecturas. Se calcularon las frecuencias alélicas de variantes (VAF) ponderadas para los loci polimórficos.

Resultos Clave

• Resistencia a la Artemisinina (Pfk13): No se detectaron mutaciones validadas o candidatas asociadas con la resistencia parcial a la artemisinina en la región del propeller de Pfk13 entre las 87 muestras secuenciadas con éxito.
• Resistencia a la Sulfadoxina-Pirimetamina (SP) (Pfdhfr/Pfdhps):
  • Pfdhfr: Se detectaron las mutaciones N51I, C59R y S108N. En Sinje, las tres mutaciones estaban fijadas (100%). En Saclepea, las frecuencias fueron 68%, 86% y 93%, respectivamente.
  • Pfdhps: Se observaron las mutaciones I431V, S436A, A437G, K540E, A581G y A613S. La mutación K540E (parte del haplotipo quíntuple) se encontró en un 13–16% en ambos sitios. La mutación A581G (haplotipo séxtuple) se detectó únicamente en Sinje (9.2%).
  • Conclusión: Aunque las tasas de mutación de Pfdhfr superaron los umbrales de la OMS, las tasas de mutación de Pfdhps (específicamente K540E y A581G) se mantuvieron por debajo del umbral del 50% utilizado para definir la eficacia comprometida de la SP.
• Resistencia a la Lumefantrina y Amodiaquina (Pfmdr1):
  • El alelo silvestre N86 predominó (frecuencia de N86Y: 5.5% en Saclepea, 0.83% en Sinje).
  • La mutación Y184F se observó en tasas moderadas (51% en Saclepea, 41% en Sinje).
  • La mutación D1246Y fue rara (0.71% en Sinje).
  • El haplotipo silvestre NYD fue el más prevalente, seguido por el haplotipo de un solo mutante NFD.
• Resistencia a la Cloroquina/Amodiaquina (Pfcrt):
  • Las mutaciones canónicas de resistencia a la cloroquina (M74I, N75E, K76T) se detectaron en el 12% de las muestras de Saclepea y el 22% de las de Sinje.
  • El haplotipo mutante CVIET se encontró en el 12% de Saclepea y el 17% de Sinje.
  • Notablemente, dos fallas de tratamiento con ASAQ (muestras recurrentes) mostraron un cambio del tipo silvestre CVMNK en la línea base al haplotipo mutante CVIET en la falla, mientras que las fallas de AL permanecieron como tipo silvestre.
• Resistencia a la Atovacuona (Pfcytb): No se identificaron mutaciones asociadas con la resistencia a la atovacuona en las 89 muestras secuenciadas con éxito.

Significancia y Afirmaciones
Los autores afirman que este estudio proporciona una caracterización molecular exhaustiva de los marcadores de resistencia antimalárica en Liberia, respaldando la continua alta eficacia de las TCA en la región.

1. Susceptibilidad a la Artemisinina: La ausencia de mutaciones en Pfk13 indica que la resistencia parcial a la artemisinina no ha emergido en los sitios de estudio.
2. Utilidad de la SP: A pesar de las altas tasas de mutación de Pfdhfr, la baja prevalencia de las mutaciones críticas de Pfdhps sugiere que no hay evidencia de una resistencia generalizada a la SP, lo que respalda su uso continuo para el tratamiento preventivo intermitente.
3. Eficacia de la AL: El perfil molecular de Pfmdr1 y Pfcrt es consistente con la continua eficacia de la AL. El predominio del alelo silvestre N86 y la baja frecuencia de D1246Y sugieren que la población de parásitos sigue siendo compatible con el tratamiento con AL.
4. Declive de la ASAQ: El estudio ofrece una explicación molecular para la disminución previamente observada en la eficacia de la ASAQ, señalando la selección del haplotipo CVIET en las fallas de tratamiento con ASAQ, lo cual es consistente con la presión de la amodiaquina.
5. Valor de la Vigilancia: Se destaca la integración de la vigilancia molecular basada en NGS con el monitoreo de la eficacia terapéutica como una herramienta crítica para informar las políticas nacionales de tratamiento y guiar las estrategias de control de la malaria.

El artículo concluye que, si bien la población de parásitos circulante puede estar predispuesta a una reducción en la susceptibilidad a la lumefantrina debido a las frecuencias de Y184F, los datos actuales respaldan el uso continuo de la AL como la terapia de primera línea en Liberia. Los autores enfatizan la necesidad de una vigilancia genómica sostenida para monitorear estas tendencias.